Сигнал или последовательность ядерной локализации ( NLS ) представляет собой аминокислотную последовательность, которая «маркирует» белок для импорта в ядро клетки посредством ядерного транспорта . [1] Обычно этот сигнал состоит из одной или нескольких коротких последовательностей положительно заряженных лизинов или аргининов, экспонированных на поверхности белка. [1] Различные белки ядерной локализации могут совместно использовать один и тот же NLS. [1] NLS имеет противоположную функцию сигнала ядерного экспорта (NES), который нацеливает белки из ядра.
Эти типы NLS можно далее классифицировать как однокомпонентные или двухкомпонентные. Основные структурные различия между ними заключаются в том, что два основных аминокислотных кластера в двухкомпонентных NLS разделены относительно короткой спейсерной последовательностью (отсюда двухкомпонентный - 2 части), в то время как однокомпонентные NLS не разделены. Первым обнаруженным NLS была последовательность PKKKRKV в большом T-антигене SV40 (однокомпонентный NLS). [2] NLS нуклеоплазмина , KR[PAATKKAGQA]KKKK, является прототипом повсеместного двухкомпонентного сигнала: два кластера основных аминокислот, разделенных спейсером примерно из 10 аминокислот. [3] Оба сигнала распознаются импортином α . Импортин α содержит сам двухкомпонентный NLS, который специфически распознается импортином β . Последний можно считать фактическим посредником импорта.
Чельский и др . предложили консенсусную последовательность KK/RXK/R для однокомпонентных NLS. [3] Последовательность Чельского может, таким образом, быть частью нижестоящего основного кластера двухкомпонентного NLS. Макка и др . провели сравнительный мутагенез сигналов ядерной локализации T-антигена SV40 (однокомпонентный), C-myc (однокомпонентный) и нуклеоплазмина (двукомпонентный) и показали аминокислотные особенности, общие для всех трех. Впервые была показана роль нейтральных и кислых аминокислот в содействии эффективности NLS. [4]
Ротелло и др . сравнили эффективность ядерной локализации eGFP-слитых NLS большого T-антигена SV40, нуклеоплазмина (AVKRPAATKKAGQAKKKKLD), EGL-13 (MSRRRKANPTKLSENAKKLAKEVEN), c-Myc (PAAKRVKLD) и TUS-белка (KLKIKRPVK) посредством быстрой внутриклеточной доставки белка. Они обнаружили значительно более высокую эффективность ядерной локализации c-Myc NLS по сравнению с NLS SV40. [5]
Существует много других типов NLS, таких как кислый домен M9 hnRNP A1, последовательность KIPIK в репрессоре транскрипции дрожжей Matα2 и сложные сигналы U snRNP. Большинство из этих NLS, по-видимому, распознаются непосредственно специфическими рецепторами семейства импортина β без вмешательства импортина α-подобного белка. [6]
Сигнал, который, по-видимому, является специфическим для массово производимых и транспортируемых рибосомальных белков [7] [8], по-видимому, исходит от специализированного набора импортных ядерных рецепторов, подобных импортину β. [9]
Недавно был предложен класс NLS, известных как PY-NLS, первоначально Ли и др. [10] Этот мотив PY-NLS, названный так из-за спаривания в нем аминокислот пролина и тирозина , позволяет белку связываться с импортином β2 (также известным как транспортин или кариоферин β2), который затем транслоцирует белок-груз в ядро. Была определена структурная основа для связывания PY-NLS, содержащегося в импортине β2, и разработан ингибитор импорта. [11]
Наличие ядерной мембраны, которая изолирует клеточную ДНК , является определяющей чертой эукариотических клеток . Таким образом, ядерная мембрана отделяет ядерные процессы репликации ДНК и транскрипции РНК от цитоплазматического процесса производства белка. Белки, необходимые в ядре, должны направляться туда каким-то механизмом. Первое прямое экспериментальное исследование способности ядерных белков накапливаться в ядре было проведено Джоном Гердоном, когда он показал, что очищенные ядерные белки накапливаются в ядре ооцитов лягушки ( Xenopus ) после микроинъекции в цитоплазму. Эти эксперименты были частью серии, которая впоследствии привела к исследованиям ядерного перепрограммирования, непосредственно связанным с исследованиями стволовых клеток.
Наличие нескольких миллионов поровых комплексов в ядерной мембране ооцита и тот факт, что они, по-видимому, пропускают множество различных молекул (инсулин, бычий сывороточный альбумин, золотые наночастицы ), привели к мнению, что поры представляют собой открытые каналы, а ядерные белки свободно проникают в ядро через поры и должны накапливаться, связываясь с ДНК или каким-либо другим ядерным компонентом. Другими словами, считалось, что не существует какого-либо специфического транспортного механизма.
Эта точка зрения была показана неверной Дингуоллом и Ласки в 1982 году. Используя белок под названием нуклеоплазмин, архетипический « молекулярный шаперон », они идентифицировали домен в белке, который действует как сигнал для проникновения в ядро. [12] Эта работа стимулировала исследования в этой области, и два года спустя первый NLS был идентифицирован в большом Т-антигене SV40 (или SV40, для краткости). Однако функциональный NLS не мог быть идентифицирован в другом ядерном белке просто на основе сходства с NLS SV40. Фактически, только небольшой процент клеточных (невирусных) ядерных белков содержал последовательность, похожую на NLS SV40. Детальное исследование нуклеоплазмина идентифицировало последовательность с двумя элементами, состоящими из основных аминокислот, разделенных спейсерным плечом. Один из этих элементов был похож на NLS SV40, но не мог направить белок в ядро клетки при присоединении к неядерному репортерному белку. Оба элемента необходимы. [13] Этот тип NLS стал известен как двудольный классический NLS. Двудольный NLS, как теперь известно, представляет собой основной класс NLS, обнаруженных в клеточных ядерных белках [14] , а структурный анализ выявил, как сигнал распознается рецепторным белком (импортином α ) [15] (структурная основа некоторых однодольных NLS также известна [16] ). Многие молекулярные детали импорта ядерного белка теперь известны. Это стало возможным благодаря демонстрации того, что импорт ядерного белка является двухэтапным процессом; ядерный белок связывается с ядерным поровым комплексом в процессе, который не требует энергии. За этим следует энергозависимая транслокация ядерного белка через канал порового комплекса. [17] [18] Установив наличие двух отдельных этапов в этом процессе, была установлена возможность идентификации вовлеченных факторов, что привело к идентификации семейства импортиновых рецепторов NLS и ГТФазы Ran .
Белки проникают в ядро через ядерную оболочку. Ядерная оболочка состоит из концентрических мембран, внешней и внутренней. Внутренняя и внешняя мембраны соединяются в нескольких местах, образуя каналы между цитоплазмой и нуклеоплазмой. Эти каналы заняты комплексами ядерных пор (NPC), сложными многобелковыми структурами, которые опосредуют транспорт через ядерную мембрану.
Белок, транслируемый с помощью NLS, будет прочно связываться с импортином (он же кариоферин ), и вместе этот комплекс будет перемещаться через ядерную пору. В этот момент Ran-GTP свяжется с комплексом импортин-белок, и его связывание приведет к тому, что импортин потеряет сродство к белку. Белок высвобождается, и теперь комплекс Ran-GTP/импортин будет перемещаться обратно из ядра через ядерную пору. Активирующий GTPase белок (GAP) в цитоплазме гидролизует Ran-GTP до GDP, и это вызывает конформационное изменение в Ran, в конечном итоге снижая его сродство к импортину. Импорт высвобождается, и Ran-GDP возвращается обратно в ядро, где фактор обмена гуаниновых нуклеотидов (GEF) обменивает свой GDP обратно на GTP.