Тест нуклеиновой кислоты ( NAT ) — это метод, используемый для обнаружения определенной последовательности нуклеиновой кислоты и, таким образом, обычно для обнаружения и идентификации определенного вида или подвида организма, часто вируса или бактерии , которые действуют как патоген в крови , тканях , моче , и т. д. NAT отличаются от других тестов тем, что они обнаруживают генетические материалы ( РНК или ДНК ), а не антигены или антитела . Обнаружение генетического материала позволяет раннюю диагностику заболевания, поскольку обнаружение антигенов и/или антител требует времени, чтобы они начали появляться в кровотоке. [1] Поскольку количество определенного генетического материала обычно очень мало, многие NAT включают этап, который амплифицирует генетический материал, то есть создает множество его копий. Такие NAT называются тестами амплификации нуклеиновых кислот ( NAAT ). Существует несколько способов амплификации, включая полимеразную цепную реакцию (ПЦР), анализ замещения цепи (SDA) или анализ, опосредованный транскрипцией (ТМА). [2]
Практически все методы амплификации нуклеиновых кислот и технологии обнаружения используют специфичность спаривания оснований Уотсона-Крика ; Молекулы одноцепочечного зонда или праймера захватывают целевые молекулы ДНК или РНК комплементарных цепей . Таким образом, конструкция цепей зонда очень важна для повышения чувствительности и специфичности обнаружения. Однако мутанты , составляющие генетическую основу ряда заболеваний человека, обычно немного отличаются от нормальных нуклеиновых кислот. Часто они отличаются только по одному основанию, например, инсерции , делеции и однонуклеотидные полиморфизмы (SNP). В этом случае легко может произойти несовершенное связывание зонда с мишенью, что приведет к ложноположительным результатам, например, к ошибочному принятию комменсального штамма за патогенный. Много исследований было посвящено достижению одноосновной специфичности.
Нити нуклеиновой кислоты (ДНК и РНК) с соответствующими последовательностями слипаются в парные цепочки, застегиваясь, как застежки-липучки, перевернутые в сушилке для одежды. Но каждый узел цепи не очень липкий, поэтому двухцепочечная цепь постоянно частично расстегивается и снова застегивается под воздействием вибраций окружающей среды (называемых тепловым шумом или броуновским движением ). Более длинные пары более стабильны. В тестах на нуклеиновые кислоты используется «зонд», который представляет собой длинную нить с прикрепленной к ней короткой нитью. Длинная цепь праймера имеет соответствующую (комплементарную) последовательность «целевой» цепи обнаруживаемого болезнетворного организма. Болезнетворная нить плотно прилипает к обнаженной части длинной нити праймера (так называемой «точки опоры»), а затем постепенно вытесняет короткую «защитную» нить из зонда. В конце концов, короткая защитная цепь ни с чем не связывается, и можно обнаружить несвязанный короткий праймер. В оставшейся части этого раздела представлена история исследований, необходимых для превращения этого процесса в полезный тест.
В 2012 году исследовательская группа Инь опубликовала статью об оптимизации специфичности гибридизации нуклеиновых кислот. [3] Они представили «зонд обмена опоры (PC)», который состоит из предварительно гибридизованной цепи комплемента C и защитной цепи P. Нить комплемента длиннее, чем защитная цепь, и на конце имеет несвязанный хвост - точку опоры. Комплемент полностью комплементарен целевой последовательности. Когда правильная мишень (X) реагирует с зондом замены опоры (PC), P высвобождается и образуется гибридный продукт XC. Стандартная свободная энергия (∆) реакции близка к нулю. С другой стороны, если зонд обмена опорой (PC) реагирует с ложной мишенью (S), реакция продолжается, но стандартная свободная энергия увеличивается и становится менее термодинамически выгодной. Стандартная разница свободной энергии (∆∆) достаточно значительна, чтобы обеспечить очевидное различие в урожайности. Коэффициент дискриминации Q рассчитывается как результат правильной целевой гибридизации, деленный на выход ложной целевой гибридизации. В ходе экспериментов с различными зондами замены опорных точек с 5 правильными мишенями и 55 ложными мишенями с энергетически репрезентативными одноосновными изменениями (замены, делеции и вставки) группа Инь пришла к выводу, что коэффициенты дискриминации этих зондов находились в диапазоне от 3 до 100 + со средним значением. 26. Зонды надежно функционируют при температуре от 10 °C до 37 °C, от 1 до 47 мМ и при концентрациях нуклеиновых кислот от 1 нМ до 5 М. Они также выяснили, что зонды для замены опор работают надежно даже при обнаружении РНК.
После этого были изучены дальнейшие исследования. В 2013 году группа Силига опубликовала статью о флуоресцентных молекулярных зондах, в которой также используется реакция обмена опоры. [4] Это позволило оптически обнаружить правильную цель и цель SNP. Им также удалось обнаружить SNP в образцах, полученных из E. coli.
В 2015 году группа Дэвида достигла чрезвычайно высокой (более 1000) селективности однонуклеотидных вариантов (SNV), внедрив систему под названием «конкурентные композиции». [5] В этой системе они построили модель кинетической реакции основных процессов гибридизации, чтобы предсказать оптимальные значения параметров, которые варьируются в зависимости от последовательностей SNV и дикого типа (WT), от конструкции архитектуры зонда и стока, а также от концентрации реагентов и условий анализа. Их модель преуспела в медианной 890-кратной селективности для 44 SNV ДНК, связанных с раком, при минимуме 200, что представляет собой как минимум 30-кратное улучшение по сравнению с предыдущими анализами, основанными на гибридизации. Кроме того, они применили эту технологию для анализа низких последовательностей VAF из геномной ДНК человека после ПЦР, а также непосредственно для синтетических последовательностей РНК.
Основываясь на этом опыте, они разработали новый метод ПЦР под названием Blocker Displacement Amplification (BDA). [6] Это термоустойчивая ПЦР, которая избирательно амплифицирует все варианты последовательностей в окне размером примерно 20 нт в 1000 раз по сравнению с последовательностями дикого типа, что позволяет легко обнаруживать и количественно оценивать сотни потенциальных вариантов, первоначально с частотой аллеля ≤ 0,1%. BDA достигает аналогичных показателей обогащения при температурах отжига от 56 °C до 64 °C. Такая температурная устойчивость облегчает мультиплексное обогащение множества различных вариантов по всему геному и, кроме того, позволяет использовать недорогие и портативные термоциклические инструменты для обнаружения редких вариантов ДНК. BDA был проверен даже на типах образцов, включая клинические образцы бесклеточной ДНК, собранные из плазмы крови пациентов с раком легких.