В энзимологии Oplophorus -люциферин 2-монооксигеназа ( EC 1.13.12.13), также известная как люцифераза Oplophorus (в этой статье упоминается как OpLuc) — это люцифераза , фермент из глубоководной креветки Oplophorus gracilirostris [2], принадлежащий к группе целентеразиновых люцифераз. В отличие от других люцифераз, она имеет более широкую субстратную специфичность [3,4,6] и также может эффективно связываться с бисдезоксицелентеразином [3,4]. Это третий пример люциферазы (кроме Aequorea и Renilla ), очищенной в лабораторных условиях [2]. Систематическое название этого класса ферментов — Oplophorus-люциферин: кислород 2-оксидоредуктаза (декарбоксилирующая) . Этот фермент также называется люциферазой Oplophorus .
Два субстрата этого фермента - люциферин , целентеразин и O 2 , а его 3 продукта - оксилюциферин , целентерамин , CO 2 и свет . Этот фермент принадлежит к семейству оксидоредуктаз , в частности, тех, которые действуют на одиночных донорах с O 2 в качестве окислителя и включением двух атомов кислорода в субстрат (оксигеназы). Включенный кислород не обязательно должен быть получен из O с включением одного атома кислорода (внутренние монооксигеназы или внутренние оксидазы со смешанной функцией). Хотя фермент является частью группы ферментов, которые действуют на целентеразин, таких как люциферазы Renilla и Gaussia , он не разделяет последовательности пар оснований с этими ферментами [3,4,5,7].
OpLuc катализирует АТФ-независимую химическую реакцию [3,4,5,6]:
Результатом этого процесса является некоторая потеря CO2 , а также фотон синего света, испускаемый при ~460 нм [2,3,4]. Эта реакция имеет оптимальный pH 9, оптимальную концентрацию соли 0,05-0,1 М и оптимальную температуру ~40 °C (что делает ее необычайно термостойкой люциферазой) [2], хотя, поскольку O.gracilirostris являются глубоководными животными, живущими при температурах ниже 20 °C, люцифераза обычно экспрессируется и сворачивается при низких температурах [6].
При стимуляции Oplophorus gracilirostris OpLuc секретируется из основания ног и антенн глубоководной креветки в качестве защитного механизма. Этот механизм заставляет O.gracilirostris выделять светящееся, ярко-синее облако люциферазы [2].
.jpeg/1280px-Oplophorus_gracilirostris_(MNHN-IU-2013-2565).jpeg)
Небольшая белковая субъединица OpLuc, 19kda, имеет аминоконцевую пептидную последовательность, которая при стимуляции подает сигнал ферменту о связывании с целентеразином, люциферином Oplophorus (субстратом) [3,7]. Как показано на рисунке 1 , фермент затем окисляет целентеразин в водной среде в люминесцентный продукт, целентерамин, и выделяет CO2 в качестве побочного продукта [2,3,7].
OpLuc представляет собой комплекс из двух ковалентно связанных [3] белковых субъединиц: двух молекул 19 кДа и двух молекул 35 кДа компонентов, что делает его гетеротетрамерной молекулой. Белки сигнализируют ферменту о секреции в люминесценции, катализируемой белком 19 кДа [3,4,7]. Люцифераза имеет много остатков цистеина, которые стабилизируют фермент во внеклеточной среде с помощью дисульфидных связей [5].
Этот каталитический компонент OpLuc имеет 196 аминокислот [3] с одним цистеином на карбоксильном конце и отличается от белков, обнаруженных в других люциферазах [4]. Белок состоит из двух доменов с повторяющейся последовательностью Ia-c и Ila-d в пептидной цепи [4]. Считается, что это белок, вызывающий биолюминесцентную реакцию O.gracilirostris , но функционирует неэффективно без своего более крупного субъединичного аналога [3,4]. Хотя кристаллическая структура OpLec еще не полностью проанализирована и не картирована, 19 кДа экспериментально экспрессировалась в клетках млекопитающих (рассматривается как KAZ [7]). Белок был выделен и мутирован для катализа яркой и устойчивой люминесцентной реакции для создания сконструированной люциферазы NanoLuc (NLuc) и аналога целентеразина (фуримазина) для использования в качестве клеточного репортера [5,8]. Мутированная ленточная модель белка массой 19 кДа (названная nanoKaz) показана на рисунке 2 .
Менее известный компонент фермента OpLuc имеет 320 аминокислот [3] с 11 молекулами цистеина и 5 молекулами лейцина [4]. Экспериментально установлено, что аминоконец белка начинается с 39 аминокислот [3]. Считается, что он стабилизирует 19 кДа и не зависит от субстратной специфичности [3], однако его точная функция неизвестна [3,4,7].
Хотя изначально предполагалось, что механизм у этой люминесцентной реакции точно такой же, как у люциферазы Renilla [1], у этой люминесценции есть два возможных пути реакции [2], как показано на рисунке 3. В верхнем пути люциферин Oplophorus (целентеразин, обозначенный на схеме как I) окисляется при соединении с O2 (в лабораторном эксперименте использовался радиоактивно меченый O18) в водной среде и использует промежуточный продукт перекиси диоксетана, что приводит к образованию продукта CO2 и целентерамида (II на схеме). Нижний путь не использует промежуточный продукт и имеет быстрый обмен кислородом с водной средой. Исследования показывают, что выход продукта меньше, и предполагается, что он частично участвует в общей реакции [2]. Однако следует отметить, что, вероятно, загрязнение CO2 во время экспериментов показало более высокий выход, чем это имело место для нижнего пути, что делает этот путь крайне маловероятным в естественных условиях [2].
