stringtranslate.com

PNGase F

Пептид: N-гликозидаза F , обычно называемая PNGазой F , представляет собой амидазу класса пептид -N4-(N-ацетил-бета-глюкозаминил)аспарагинамидазы . PNGаза F работает путем расщепления между самыми внутренними остатками GlcNAc и аспарагином высокоманнозных , гибридных и сложных олигосахаридов из N-связанных гликопротеинов и гликопептидов. В результате образуется дезаминированный белок или пептид и свободный гликан . [1] [2]

PNGаза F имеет молекулярную массу 35 500 и состоит из полипептидной цепи из 314 аминокислот. [3] Оптимальный pH для активности ферментов составляет 8,6. Однако активность стабильна для широкого спектра условий и реагентов. PNGase F сохраняет 60% активность при pH от 6,0 до pH 9,5. Он способен дегликозилировать в отсутствие денатурантов, но требует интенсивной инкубации и большего количества фермента для расщепления нативных белков. [1] [4] [5]

Другие эндогликозидазы , подобные PNGазе F, включают эндогликозидазу F1, эндогликозидазу F2, эндогликозидазу F3 и эндогликозидазу H. [6] [7] [8] Эти эндогликозидазы обладают большей специфичностью в расщеплении и менее чувствительны к конформации белка, чем PNGаза F. [ 1] [9] [10] Все эти эндогликозидазы, включая PNGазу F, можно очистить из миндальной эмульсии или флавобактерии meningosepticum . [1] [6] [10] [11] [12]

Механизм

PNGаза F катализирует расщепление внутренней гликозидной связи в олигосахариде. Он расщепляет все связанные с аспарагином комплексные, гибридные олигосахариды или олигосахариды с высоким содержанием маннозы, за исключением случаев, когда ядро ​​GlcNAc содержит альфа-1,3-фукозу. [1]

Сайты расщепления PNGase F.

Остаток аспарагина, из которого удален гликан, дезаминируется до аспарагиновой кислоты .

PNGаза F расщепляет гликан и дезаминирует аспарагин до аспарагиновой кислоты.

Для осуществления катализа PNGase F требует как минимум двух остатков олигосахарида GlcNAc, присоединенных к аспарагину. [12] Этот фермент использует каталитическую триаду цистеин-гистидин-аспартат в своем активном центре, что является общим мотивом для амидаз. Этот мотив содержит нуклеофил , донор протона и положительный заряд для стабилизации тетраэдрического промежуточного соединения . Было обнаружено, что кристаллическая структура PNGазы F из flavobacterium Miningosepticum с разрешением 1,8 Å свернута в два домена, каждый из которых имеет восьминитевую антипараллельную конфигурацию β-цилиндра или желеобразного рулона. Эта структура аналогична лектинам и глюканазам , что предполагает сходство с лектинами и другими углеводсвязывающими белками. [3]

Приложения и использование

С биологической точки зрения дефицит эндогликозидаз может привести к ряду заболеваний, включая лизосомальные болезни накопления и мультисистемные заболевания, большинство из которых поражают нервную систему. [13] [14] N-связанные гликаны могут обеспечивать структурные компоненты клеточных стенок и внеклеточных матриксов, изменять стабильность и растворимость белков, прямой транспорт других гликопротеинов и опосредовать передачу сигналов между клетками (взаимодействия между клетками и взаимодействия между клетками и матрицей). [15] N-связанное гликозилирование можно увидеть в антителах , на клеточных поверхностях и в различных белках по всему матриксу. Изменения гликозилирования часто возникают в случаях рака и воспаления, что может иметь важные функциональные последствия. [16]

С этой целью PNGаза F и другие эндогликозидазы могут быть использованы для изучения олигосахаридов и характеристики гликопротеинов. PNGase F не обладает избирательностью к внешней структуре углеводов, что приводит к широкой специфичности, что делает ее полезным инструментом для исследования структуры и функции гликопротеинов. [3] В большинстве случаев интересующие белки денатурируют и обрабатывают PNGазой F. После этого они либо подвергаются гель-электрофореза , при котором миграция белков изменяется из-за дегликозилирования PNGазой F, либо анализируются с помощью масс-спектрометрии , с помощью которого можно охарактеризовать олигосахарид и можно охарактеризовать белок или пептидный фрагмент, из которого он произошел. [3] [7] [8]

Рекомендации

  1. ^ abcde Тарентино А.Л., Тримбл Р.Б., Пламмер Т.Х. (1989). Ферментативные подходы к изучению структуры, синтеза и процессинга гликопротеинов . Методы клеточной биологии. Том. 32. С. 111–39. дои : 10.1016/S0091-679X(08)61169-3. ISBN 978-0-08-085930-9. ПМИД  2691848.
  2. ^ Тарентино А.Л., Пламмер Т.Х. (1994). «[4] Ферментативное дегликозилирование аспарагин-связанных гликанов: очистка, свойства и специфичность ферментов, расщепляющих олигосахариды, из Flavobacterium meningosepticum». Ферментативное дегликозилирование аспарагин-связанных гликанов: очистка, свойства и специфичность ферментов, расщепляющих олигосахариды, из Flavobacterium meningosepticum . Методы энзимологии. Том. 230. стр. 44–57. дои : 10.1016/0076-6879(94)30006-2. ISBN 9780121821319. ПМИД  8139511.
  3. ^ abcd Норрис Дж.Э., Стиллман Т.Дж., Андерсон Б.Ф., Бейкер Э.Н. (1994). «Трехмерная структура PNGазы F, гликозиласпарагиназы из Flavobacterium meningosepticum». Состав . 2 (11): 1049–59. дои : 10.1016/S0969-2126(94)00108-1 . ПМИД  7881905.
  4. ^ Энтони Л., Тарентино и Томас Х. Пламмер-младший. «Ферментативное дегликозилирование аспарагин-связанных гликанов: очистка, свойства и специфичность ферментов, расщепляющих олигосахариды, из Flavobacterium meningosepticum». Методы энзимологии. 230. 1994. 44-57. Веб.
  5. ^ Тарентино А.Л., Пламмер Т.Х. (1982). «Доступность олигосахаридов для пептида: N-гликозидазы, чему способствуют реагенты, разворачивающие белки». Журнал биологической химии . 257 (18): 10776–80. дои : 10.1016/S0021-9258(18)33891-2 . ПМИД  7107633.
  6. ^ аб Такахаши Т., Нишибе Х (1981). «Миндальная гликопептидаза, действующая на аспартилгликозиламиновые связи. Множественность и субстратная специфичность». Biochimica et Biophysical Acta (BBA) - Энзимология . 657 (2): 457–67. дои : 10.1016/0005-2744(81)90331-4. ПМИД  7213757.
  7. ^ ab Малей Ф., Тримбл Р.Б., Тарентино А.Л., Пламмер Т.Х. (1989). «Характеристика гликопротеинов и связанных с ними олигосахаридов с помощью эндогликозидаз». Аналитическая биохимия . 180 (2): 195–204. дои : 10.1016/0003-2697(89)90115-2. ПМИД  2510544.
  8. ^ аб Татибана Ю, Ямашита К, Кобата А (1982). «Субстратная специфичность эндо-бета-N-ацетилглюкозаминидазы млекопитающих: исследование с ферментом печени крысы». Архив биохимии и биофизики . 214 (1): 199–210. дои : 10.1016/0003-9861(82)90023-6. ПМИД  6805439.
  9. ^ Тага Э.М., Вахид А., Ван Эттен Р.Л. (1984). «Структурная и химическая характеристика гомогенной пептидной N-гликозидазы миндаля». Биохимия . 23 (5): 815–22. дои : 10.1021/bi00300a006. ПМИД  6712926.
  10. ^ аб Тарентино А.Л., Гомес CM, Пламмер TH (1985). «Дегликозилирование аспарагин-связанных гликанов пептидом: N-гликозидазой F». Биохимия . 24 (17): 4665–71. дои : 10.1021/bi00338a028. ПМИД  4063349.
  11. ^ Пламмер Т.Х., Тарентино А.Л. (1981). «Легкое расщепление сложных олигосахаридов из гликопептидов с помощью пептида миндального эмульсина: N-гликозидазы» (PDF) . Журнал биологической химии . 256 (20): 10243–6. дои : 10.1016/S0021-9258(19)68610-2 . ПМИД  7287707.
  12. ^ аб Пламмер Т.Х., Фелан А.В., Тарентино А.Л. (1987). «Обнаружение и количественное определение пептид-N4-(N-ацетил-бета-глюкозаминил)аспарагинамидазы». Европейский журнал биохимии . 163 (1): 167–73. дои : 10.1111/j.1432-1033.1987.tb10751.x . ПМИД  2434326.
  13. ^ Дэвис Дж., Хенриссат Б (1995). «Структуры и механизмы гликозилгидролаз». Состав . 3 (9): 853–9. дои : 10.1016/S0969-2126(01)00220-9 . ПМИД  8535779.
  14. ^ Паттерсон MC (2005). «Метаболические мимики: нарушения N-связанного гликозилирования». Семинары по детской неврологии . 12 (3): 144–51. дои : 10.1016/j.spen.2005.10.002. ПМИД  16584073.
  15. ^ Варки А., Каммингс Р.Д., Эско Дж.Д., Фриз Х.Х., Стэнли П., Бертоцци С.Р., Харт Г.В., Эцлер М.Э., Варки А., Шэрон Н. (2009). «Историческая справка и обзор». В Варки А (ред.). Основы гликобиологии (2-е изд.). Колд-Спринг-Харбор, Нью-Йорк: Лабораторное издательство Колд-Спринг-Харбор. ISBN 978-0-87969-770-9. ПМИД  20301255.
  16. ^ Роудс Дж., Кэмпбелл Б.Дж., Ю Л.Г. (2001). «Гликозилирование и болезни». Энциклопедия наук о жизни . John Wiley & Sons, Inc. doi : 10.1002/9780470015902.a0002151.pub2. ISBN 978-0-470-01590-2.