stringtranslate.com

Считыватель пластин

Считыватель микропланшетов BioTek PowerWave XS

Считыватели планшетов , также известные как считыватели микропланшетов или фотометры микропланшетов , представляют собой приборы, которые используются для обнаружения биологических , химических или физических событий в образцах на микротитровальных планшетах . Они широко используются в исследованиях, разработке лекарств , [1] проверке биопроб, контроле качества и производственных процессах в фармацевтической и биотехнологической промышленности и академических организациях. Реакции образцов можно анализировать в микротитровальных планшетах формата 1-1536 лунок. Наиболее распространенный формат микропланшетов, используемый в академических исследовательских лабораториях или клинических диагностических лабораториях, — это 96-луночный (матрица 8 на 12) с типичным объемом реакции от 100 до 200 мкл на лунку. Микропланшеты с более высокой плотностью (микропланшеты с 384 или 1536 лунками) обычно используются для скрининговых приложений, когда пропускная способность (количество обработанных образцов в день) и стоимость анализа на образец становятся критическими параметрами, с типичным объемом анализа от 5 до 50 мкл на лунку. Обычными режимами детекции для микропланшетных анализов являются поглощение, интенсивность флуоресценции , люминесценция , флуоресценция с временным разрешением и поляризация флуоресценции .

Методы

Поглощение

Детектирование поглощения доступно в ридерах для микропланшетов уже более 3 десятилетий и используется для таких анализов, как анализы ИФА , количественное определение белков и нуклеиновых кислот или анализы активности ферментов [2] (т. е. в анализе МТТ для определения жизнеспособности клеток). [3] Источник света освещает образец, используя определенную длину волны (выбранную оптическим фильтром или монохроматором), а детектор света, расположенный с другой стороны лунки, измеряет, сколько начального (100%) света пропускается через образец: количество пропущенного света, как правило, будет связано с концентрацией интересующей молекулы. Несколько обычных колориметрических анализов были миниатюризированы для количественного функционирования в ридере для планшетов с производительностью, подходящей для исследовательских целей. Примеры анализов, преобразованных в методы ридера для планшетов, включают несколько для аммония , нитрата , нитрита , [4] мочевины , [5] железа (II), [6] и ортофосфата . [7] Более поздние колориметрические химические вещества были разработаны непосредственно для использования в планшетных ридерах. [8]

Флуоресценция

За последние два десятилетия детектирование интенсивности флуоресценции получило очень широкое развитие в формате микропланшетов. Диапазон применения гораздо шире, чем при использовании детектирования поглощения, но аппаратура обычно более дорогая. В этом типе аппаратуры первая оптическая система (система возбуждения) освещает образец с использованием определенной длины волны (выбранной оптическим фильтром или монохроматором). В результате освещения образец излучает свет (флуоресцирует), а вторая оптическая система (система излучения) собирает излучаемый свет, отделяет его от возбуждающего света (используя систему фильтра или монохроматора) и измеряет сигнал с помощью детектора света, такого как фотоумножительная трубка (ФЭУ). Преимуществами детектирования флуоресценции перед детектированием поглощения являются чувствительность, а также диапазон применения, учитывая широкий выбор флуоресцентных меток, доступных сегодня. Например, метод, известный как кальциевая визуализация, измеряет интенсивность флуоресценции чувствительных к кальцию красителей для оценки внутриклеточных уровней кальция. [9]

Люминесценция

Люминесценция является результатом химической или биохимической реакции. Детекция люминесценции оптически проще, чем детекция флуоресценции, поскольку люминесценция не требует источника света для возбуждения или оптики для выбора дискретных длин волн возбуждения. Типичная оптическая система люминесценции состоит из светонепроницаемой считывающей камеры и детектора ФЭУ . Некоторые считыватели планшетов используют аналоговый детектор ФЭУ, в то время как другие имеют детектор ФЭУ для подсчета фотонов . Подсчет фотонов широко принят как наиболее чувствительный способ обнаружения люминесценции. Некоторые считыватели планшетов предлагают оптические системы с колесом фильтров или настраиваемым монохроматором длины волны для выбора определенных длин волн люминесценции. Возможность выбора нескольких длин волн или даже диапазонов длин волн позволяет обнаруживать анализы, содержащие несколько люминесцентных репортерных ферментов, разрабатывать новые анализы люминесценции, а также оптимизировать соотношение сигнал/шум. [ необходима ссылка ]

Распространенные приложения включают анализы экспрессии генов на основе люциферазы , а также анализы жизнеспособности клеток, цитотоксичности и биоритмов, основанные на люминесцентном обнаружении АТФ . [10]

Флуоресценция с временным разрешением (TRF)

Измерение флуоресценции с временным разрешением (TRF) очень похоже на измерение интенсивности флуоресценции (FI). Единственное отличие заключается во времени процесса возбуждения/измерения. При измерении FI процессы возбуждения и испускания происходят одновременно: свет, испускаемый образцом, измеряется во время возбуждения. Несмотря на то, что системы испускания очень эффективны в удалении возбуждающего света до того, как он достигнет детектора, количество возбуждающего света по сравнению с испускаемым светом таково, что измерения FI всегда показывают довольно высокие фоновые сигналы. TRF предлагает решение этой проблемы. Он основан на использовании очень специфических флуоресцентных молекул, называемых лантаноидами , которые обладают необычным свойством испускать свет в течение длительных периодов времени (измеряемых в миллисекундах) после возбуждения, тогда как большинство стандартных флуоресцентных красителей (например, флуоресцеин) испускают свет в течение нескольких наносекунд после возбуждения. В результате можно возбуждать лантаноиды с помощью импульсного источника света (например, ксеноновой лампы-вспышки или импульсного лазера) и проводить измерения после импульса возбуждения. Это приводит к более низкому фону измерений, чем в стандартных анализах FI. Недостатки в том, что приборы и реагенты обычно более дороги, и что приложения должны быть совместимы с использованием этих очень специфических красителей лантаноидов. Основное применение TRF находится в приложениях скрининга лекарств в форме, называемой TR-FRET (временно-разрешенный перенос энергии флуоресценции). Анализы TR- FRET очень надежны (ограниченная чувствительность к нескольким типам помех анализа) и легко миниатюризируются. Надежность, возможность автоматизации и миниатюризации являются особенностями, которые весьма привлекательны в скрининговой лаборатории. [ необходима цитата ]

Поляризация флуоресценции

Измерение поляризации флуоресценции также очень близко к детектированию FI. Разница в том, что оптическая система включает поляризующие фильтры на пути света: образцы в микропланшете возбуждаются с помощью поляризованного света (вместо неполяризованного света в режимах FI и TRF). В зависимости от подвижности флуоресцентных молекул, обнаруженных в лунках, излучаемый свет будет либо поляризованным, либо нет. Например, крупные молекулы (например, белки) в растворе, которые вращаются относительно медленно из-за своего размера, будут излучать поляризованный свет при возбуждении поляризованным светом. С другой стороны, быстрое вращение более мелких молекул приведет к деполяризации сигнала. Система излучения планшетного ридера использует поляризующие фильтры для анализа полярности излучаемого света. Низкий уровень поляризации указывает на то, что небольшие флуоресцентные молекулы свободно перемещаются в образце. Высокий уровень поляризации указывает на то, что флуоресцент присоединен к более крупному молекулярному комплексу. В результате одним из основных применений обнаружения флуоресценции является анализ молекулярного связывания, поскольку он позволяет определить, связывается ли небольшая флуоресцентная молекула (или нет) с более крупной нефлуоресцентной молекулой: связывание приводит к снижению скорости вращения флуоресцентной молекулы и увеличению поляризации сигнала. [ необходима цитата ]

Рассеяние света и нефелометрия

Рассеивание света и нефелометрия являются методами определения мутности раствора (т. е. нерастворимых частиц в растворе). Световой луч проходит через образец, и свет рассеивается взвешенными частицами. Измеренный прямой рассеянный свет указывает на количество нерастворимых частиц, присутствующих в растворе. Обычные приложения нефелометрии/рассеивания света включают автоматизированный скрининг растворимости лекарств HTS, долгосрочную кинетику роста микроорганизмов, флокуляцию, агрегацию и мониторинг полимеризации и осаждения, включая иммунопреципитацию. [ необходима цитата ]

Инструменты и анализы

Многие режимы детекции (поглощение, интенсивность флуоресценции, люминесценция, флуоресценция с временным разрешением и поляризация флуоресценции) доступны по отдельности в специализированных планшетных ридерах, но сегодня их очень часто можно встретить объединенными в один прибор (многомодовый планшетный ридер). Существуют также приборы для измерения динамического или статического света, рассеянного образцами в микропланшете. Диапазон применения многомодовых планшетных ридеров чрезвычайно широк. Вот некоторые из наиболее распространенных анализов:

Хотя «планшетный ридер» обычно относится к устройствам, описанным выше, доступно много вариаций. Вот некоторые примеры других устройств, работающих с форматом микропланшета:

Ссылки

  1. ^ Невес, Бруно Младший; Агнес, Джонатан Пауло; Гомеш, Марсело ду Насименту; Энрикес Донса, Марсио Роберто; Гонсалвес, Розангела Майер; Дельгобо, Марина; Рибейру де Соуза Нето, Лауро; Сенгер, Марио Роберто; Сильва-Жуниор, Флориано Паес; Феррейра, Сабрина Баптиста; Занотто-Фильо, Алфеу; Андраде, Каролина Орта (март 2020 г.). «Эффективная идентификация новых свинцовых соединений против глиомы с помощью моделей машинного обучения». Европейский журнал медицинской химии . 189 : 111981. doi :10.1016/j.ejmech.2019.111981. PMID  31978780. S2CID  210892159.
  2. ^ Ашур, Мохамед-Бассем А.; Джи, Ширли Дж.; Хаммок, Брюс Д. (ноябрь 1987 г.). «Использование 96-луночного микропланшетного ридера для измерения обычной ферментативной активности». Аналитическая биохимия . 166 (2): 353–360. doi :10.1016/0003-2697(87)90585-9. PMID  3434778.
  3. ^ Мосманн, Тим (декабрь 1983 г.). «Быстрый колориметрический анализ клеточного роста и выживания: применение к анализам пролиферации и цитотоксичности». Журнал иммунологических методов . 65 (1–2): 55–63. doi :10.1016/0022-1759(83)90303-4. PMID  6606682.
  4. ^ Sims, GK; Ellsworth, TR; Mulvaney, RL (11 ноября 2008 г.). «Микромасштабное определение неорганического азота в воде и почвенных вытяжках». Communications in Soil Science and Plant Analysis . 26 (1–2): 303–316. doi :10.1080/00103629509369298.
  5. ^ Гринан, Н. С.; Малвани, Р. Л.; Симс, Г. К. (11 ноября 2008 г.). «Микромасштабный метод колориметрического определения мочевины в почвенных экстрактах». Communications in Soil Science and Plant Analysis . 26 (15–16): 2519–2529. doi :10.1080/00103629509369465.
  6. ^ Tor, Jason M.; Xu, Caifen; Stucki, Joseph M.; Wander, Michelle M.; Sims, Gerald K. (август 2000 г.). «Деградация трифлуралина в условиях микробиологически индуцированного нитрата и восстановления Fe(III)». Environmental Science & Technology . 34 (15): 3148–3152. Bibcode : 2000EnST...34.3148T. doi : 10.1021/es9912473.
  7. ^ D'Angelo, Elisa; Crutchfield, J.; Vandiviere, M. (ноябрь 2001 г.). «Быстрое, чувствительное, микромасштабное определение фосфата в воде и почве». Журнал качества окружающей среды . 30 (6): 2206–2209. doi :10.2134/jeq2001.2206. PMID  11790034.
  8. ^ Райн, Э.Д.; Малвани, Р.Л.; Пратт, Э.Дж.; Симс, Г.К. (1998). «Улучшение реакции Бертло для определения аммония в почвенных вытяжках и воде». Журнал Американского общества почвоведения . 62 (2): 473. Bibcode : 1998SSASJ..62..473R. doi : 10.2136/sssaj1998.03615995006200020026x.
  9. ^ Лин, Кедан; Саде, Вольфганг; Марк Куиллан, Дж. (февраль 1999 г.). «Быстрые измерения внутриклеточного кальция с использованием флуоресцентного планшетного ридера». BioTechniques . 26 (2): 318–326. doi : 10.2144/99262rr02 . PMID  10023544.
  10. ^ Лин, Кедан; Саде, Вольфганг; Марк Куиллан, Дж. (февраль 1999 г.). «Быстрые измерения внутриклеточного кальция с использованием флуоресцентного планшетного ридера». BioTechniques . 26 (2): 318–326. doi : 10.2144/99262rr02 . PMID  10023544.
  11. ^ Ашур, Мохамед-Бассем А.; Джи, Ширли Дж.; Хаммок, Брюс Д. (ноябрь 1987 г.). «Использование 96-луночного микропланшетного ридера для измерения обычной ферментативной активности». Аналитическая биохимия . 166 (2): 353–360. doi :10.1016/0003-2697(87)90585-9. PMID  3434778.
  12. ^ "AlphaScreen | BMG LABTECH".
  13. ^ Супрун, Мария; Геттс, Роберт; Рагхунатхан, Рохит; Гришина, Галина; Витмер, Марк; Хименес, Густаво; Сэмпсон, Хью А.; Суарес-Фариньяс, Майте (5 декабря 2019 г.). «Новый анализ эпитопов на основе шариков — чувствительный и надежный инструмент для профилирования репертуара антител, специфичных к эпитопам, при пищевой аллергии». Scientific Reports . 9 (1): 18425. Bibcode :2019NatSR...918425S. doi :10.1038/s41598-019-54868-7. PMC 6895130 . PMID  31804555. 
  14. ^ Шин, Хе Джи; Квак, Минджонг; Джу, Сихва; Ли, Джи Юн (2022). «Количественная оценка поглощения флуоресцентных наночастиц клетками млекопитающих с использованием планшетного ридера». Scientific Reports . 12 (1): 20146. Bibcode :2022NatSR..1220146S. doi :10.1038/s41598-022-24480-3. PMC 9684140 . PMID  36418509.