stringtranslate.com

RecBCD

Экзодезоксирибонуклеаза V (EC 3.1.11.5, RecBCD, экзонуклеаза V, экзонуклеаза V Escherichia coli , экзонуклеаза V E. coli , ген эндофермента RecBC, дезоксирибонуклеаза RecBC, ген ДНКаза RecBC, ген ферментов RecBCD ) — фермент E. coli , инициирующий рекомбинационную репарацию . от потенциально смертельных двухцепочечных разрывов ДНК , которые могут возникнуть в результате ионизирующего излучения , ошибок репликации, эндонуклеаз , окислительного повреждения и множества других факторов. [2] [3] Фермент RecBCD представляет собой одновременно хеликазу , которая раскручивает или разделяет цепи ДНК, и нуклеазу , которая делает одноцепочечные разрывы в ДНК. [1] Он катализирует экзонуклеолитическое расщепление (в присутствии АТФ) либо в направлении от 5'-к 3'-, либо от 3'-к 5'-направлению с образованием 5'-фосфоолигонуклеотидов.

Состав

Ферментный комплекс состоит из трех различных субъединиц, называемых RecB, RecC и RecD, поэтому комплекс получил название RecBCD (рис. 1). До открытия гена RecD [4] фермент был известен как RecBC. Каждая субъединица кодируется отдельным геном:

Функция

Рисунок 2. Путь гомологичной рекомбинации RecBCD, при котором АТФ находится в избытке.

Субъединицы RecD и RecB являются хеликазами, т.е. энергозависимыми молекулярными моторами, которые раскручивают ДНК (или РНК в случае других белков). Субъединица RecB, кроме того, выполняет нуклеазную функцию. [5] Наконец, фермент RecBCD (возможно, субъединица RecC) распознает специфическую последовательность в ДНК, 5' -GCTGGTGG- 3' , известную как Chi (иногда обозначаемую греческой буквой χ).

RecBCD необычен среди геликаз, поскольку он имеет две геликазы, которые перемещаются с разной скоростью [6] , а также потому, что он может распознавать и изменять последовательность ДНК Chi. [7] [8] RecBCD активно связывает конец линейной двухцепочечной (дц) ДНК. Хеликаза RecD перемещается по цепи с 5'-концом, на которой фермент инициирует раскручивание, а RecB - по цепи с 3'-концом. RecB медленнее, чем RecD, поэтому одноцепочечная (ss) петля ДНК накапливается перед RecB (рис. 2). В результате образуются структуры ДНК с двумя ss-хвостами (более коротким 3'-концевым хвостом и более длинным 5'-концевым хвостом) и одной ss-петлей (на 3'-концевой цепи), наблюдаемыми с помощью электронной микроскопии. [9] Хвосты из нержавеющей стали могут отжигаться, образуя вторую петлю из нержавеющей стали, дополняющую первую; такие двухпетлевые структуры первоначально назывались «кроличьими ушками».

Механизм действия

Рисунок 3. Начало пути гомологичной рекомбинации RecBCD, где Mg 2+ находится в избытке.

При раскручивании нуклеаза в RecB может действовать по-разному в зависимости от условий реакции, в частности от соотношения концентраций ионов Mg 2+ и АТФ. (1) Если АТФ в избытке, фермент просто разрывает цепь с Chi (цепь с начальным 3'-концом) (рис. 2). [10] [11] Раскручивание продолжается и образует 3'-хвост с Ци вблизи его конца. Этот хвост может быть связан с белком RecA, который способствует обмену цепей с интактным гомологичным дуплексом ДНК. [12] Когда RecBCD достигает конца ДНК, все три субъединицы разбираются, и фермент остается неактивным в течение часа или более; [13] молекула RecBCD, действовавшая на Chi, не атакует другую молекулу ДНК. (2) При избытке ионов Mg 2+ RecBCD эндонуклеолитически расщепляет обе цепи ДНК, хотя 5'-хвост расщепляется реже (рис. 3). [14] Когда RecBCD встречает сайт Chi на 3'-концевой цепи, паузы в раскручивании и переваривание 3'-хвоста замедляются. [15] Когда RecBCD возобновляет раскручивание, он теперь расщепляет противоположную цепь ( т.е. 5'-хвост) [16] [17] и загружает белок RecA на 3'-концевую цепь. [12] После завершения реакции на одной молекуле ДНК фермент быстро атакует вторую ДНК, на которой происходят те же реакции, что и на первой ДНК.

Хотя ни одна реакция не была подтверждена анализом внутриклеточной ДНК, из-за временного характера промежуточных продуктов реакции генетические данные указывают на то, что первая реакция более близко имитирует реакцию в клетках. [2] Например, на активность Chi влияют нуклеотиды с его 3'-стороны как в клетках, так и в реакциях с избытком АТФ, но не с избытком Mg 2+ [PMIDs 27401752, 27330137]. Мутанты RecBCD, лишенные обнаруживаемой экзонуклеазной активности, сохраняют высокую активность горячих точек Chi в клетках и разрывают Chi вне клеток. [18] Сайт Chi на одной молекуле ДНК в клетках снижает или устраняет активность Chi на другой ДНК, возможно, отражая Chi-зависимую разборку RecBCD, наблюдаемую in vitro в условиях избытка АТФ и разрыва ДНК по Chi. [19] [20]

В обоих условиях реакции 3'-цепь остается неповрежденной ниже Chi. Затем белок RecA активно загружается на 3'-хвост с помощью RecBCD. [12] В какой-то неопределенный момент RecBCD отделяется от ДНК, хотя RecBCD может раскручивать по меньшей мере 60 т.п.н. ДНК, не отваливаясь. RecA инициирует замену цепи ДНК, с которой она связана, на идентичную или почти идентичную цепь в интактном дуплексе ДНК; в результате этого обмена цепями образуется совместная молекула ДНК, такая как D-петля (рис. 2). Считается, что совместная молекула ДНК расщепляется либо путем репликации, инициируемой вторгающейся 3'-концевой цепью, содержащей Chi, либо путем расщепления D-петли и образования соединения Холлидея. Соединение Холлидея может быть преобразовано в линейную ДНК с помощью комплекса RuvABC или диссоциировано с помощью белка RecG. Каждое из этих событий может генерировать интактную ДНК с новыми комбинациями генетических маркеров, по которым родительские ДНК могут отличаться. Этот процесс, гомологичная рекомбинация , завершает восстановление двухцепочечного разрыва ДНК.

Приложения

RecBCD — это модельный фермент, позволяющий использовать флуоресценцию одиночных молекул в качестве экспериментального метода, используемого для лучшего понимания функции взаимодействий белок-ДНК. [21] Фермент также полезен при удалении линейной ДНК, как одно-, так и двухцепочечной, из препаратов кольцевой двухцепочечной ДНК, поскольку для активности ему требуется конец ДНК.

Рекомендации

  1. ^ ab Синглтон М.Р., Диллингем М.С., Годье М., Ковальчиковски С.К., Вигли Д.Б. (ноябрь 2004 г.). «Кристаллическая структура фермента RecBCD раскрывает механизм обработки разрывов ДНК». Природа . 432 (7014): 187–93. Бибкод : 2004Natur.432..187S. дои : 10.1038/nature02988. PMID  15538360. S2CID  2916995.
  2. ^ Аб Смит, GR (июнь 2012 г.). «Как фермент RecBCD и Chi способствуют восстановлению и рекомбинации разрывов ДНК: взгляд молекулярного биолога». Микробиол Мол Биол Rev. 76 (2): 217–28. дои : 10.1128/MMBR.05026-11. ПМЦ 3372252 . ПМИД  22688812. 
  3. ^ Шпионы М, Ковальчиковски СК (2003). «Гомологичная рекомбинация по путям RecBCD и RecF». В Хиггинсе П. (ред.). Бактериальные хромосомы . Вашингтон, округ Колумбия: ASM Press. стр. 389–403. ISBN 1-55581-232-5.
  4. ^ Амундсен С.К., Тейлор А.Ф., Чаудхури А.М., Смит Г.Р. (август 1986 г.). «recD: ген незаменимой третьей субъединицы экзонуклеазы V». Proc Natl Acad Sci США . 83 (15): 5558–62. Бибкод : 1986PNAS...83.5558A. дои : 10.1073/pnas.83.15.5558 . ПМК 386327 . ПМИД  3526335. 
  5. ^ Ю М, Суайя Дж, Жюлин Д.А. (февраль 1998 г.). «С-концевой домен белка RecB массой 30 кДа имеет решающее значение для нуклеазной активности, но не геликазной активности фермента RecBCD из Escherichia coli». Proc Natl Acad Sci США . 95 (3): 981–6. Бибкод : 1998PNAS...95..981Y. дои : 10.1073/pnas.95.3.981 . ЧВК 18645 . ПМИД  9448271. 
  6. ^ Тейлор А.Ф., Смит Г.Р. (июнь 2003 г.). «Фермент RecBCD представляет собой ДНК-геликазу с быстрым и медленным моторами противоположной полярности». Природа . 423 (6942): 889–93. Бибкод : 2003Natur.423..889T. дои : 10.1038/nature01674. PMID  12815437. S2CID  4302346.
  7. ^ Тейлор А.Ф., Смит Г.Р. (июнь 1992 г.). «Фермент RecBCD изменяется при разрезании ДНК в горячей точке рекомбинации Chi». Proc Natl Acad Sci США . 89 (12): 5226–30. Бибкод : 1992PNAS...89.5226T. дои : 10.1073/pnas.89.12.5226 . ПМК 49264 . ПМИД  1535156. 
  8. ^ Амундсен С.К., Тейлор А.Ф., Редди М., Смит Г.Р. (декабрь 2007 г.). «Межсубъединичная передача сигналов в ферменте RecBCD, сложной белковой машине, регулируемой горячими точками Чи». Генс Дев . 21 (24): 3296–307. дои : 10.1101/gad.1605807. ПМК 2113030 . ПМИД  18079176. 
  9. ^ Тейлор А., Смит Г.Р. (ноябрь 1980 г.). «Раскручивание и перемотка ДНК ферментом RecBC». Клетка . 22 (2, часть 2): 447–57. дои : 10.1016/0092-8674(80)90355-4. PMID  6256081. S2CID  22123298.
  10. ^ Понтичелли, AS; Шульц, Д.В.; Тейлор, А.Ф.; Смит, Г. Р. (май 1985 г.). «Хи-зависимое расщепление цепи ДНК ферментом RecBC». Клетка . 41 (1): 145–151. дои : 10.1016/0092-8674(85)90069-8. PMID  3888404. S2CID  38361329.
  11. ^ Тейлор А.Ф., Шульц Д.В., Понтичелли А.С., Смит Г.Р. (май 1985 г.). «Фермент RecBC, разрезающий сайты Chi во время раскручивания ДНК: расположение и зависимость от ориентации разреза». Клетка . 41 (1): 153–63. дои : 10.1016/0092-8674(85)90070-4. PMID  3888405. S2CID  8551482.
  12. ^ abc Андерсон Д.Г., Ковальчиковски СК (июль 1997 г.). «Транлоцирующий фермент RecBCD стимулирует рекомбинацию, направляя белок RecA на оцДНК Chi-регулируемым способом». Клетка . 90 (1): 77–86. дои : 10.1016/S0092-8674(00)80315-3 . ПМИД  9230304.
  13. ^ Тейлор А.Ф., Смит Г.Р. (апрель 1999 г.). «Регуляция гомологичной рекомбинации: Chi инактивирует фермент RecBCD путем разборки трех субъединиц». Генс Дев . 13 (7): 890–900. дои : 10.1101/gad.13.7.890. ПМК 316601 . ПМИД  10197988. 
  14. ^ Диксон Д.А., Ковальчиковски СК (апрель 1993 г.). «Горячая точка рекомбинации Chi представляет собой регуляторную последовательность, которая действует путем ослабления нуклеазной активности фермента RecBCD E. coli ». Клетка . 73 (1): 87–96. дои : 10.1016/0092-8674(93)90162-J. PMID  8384931. S2CID  19718817.
  15. ^ Шпионы М, Амитани I, Баскин Р.Дж., Ковальчиковски СК (ноябрь 2007 г.). «Ферментные переключатели RecBCD приводят моторные субъединицы в ответ на распознавание Чи». Клетка . 131 (4): 694–705. дои : 10.1016/j.cell.2007.09.023. ПМК 2151923 . ПМИД  18022364. 
  16. ^ Тейлор А.Ф., Смит Г.Р. (октябрь 1995 г.). «Специфичность цепи разрыва ДНК в сайтах Chi ферментом RecBCD. Модуляция за счет уровней АТФ и магния». J Биол Хим . 270 (41): 24459–67. дои : 10.1074/jbc.270.41.24459 . ПМИД  7592661.
  17. ^ Андерсон Д.Г., Ковальчиковски СК (март 1997 г.). «Горячая точка рекомбинации ци является регуляторным элементом, который переключает полярность деградации ДНК ферментом RecBCD». Генс Дев . 11 (5): 571–81. дои : 10.1101/gad.11.5.571 . ПМИД  9119222.
  18. ^ Амундсен С.К., Смит Г.Р. (январь 2007 г.). «Активность горячей точки Chi в Escherichia coli без активности экзонуклеазы RecBCD: значение для механизма рекомбинации». Генетика . 175 (1): 41–54. doi : 10.1534/genetics.106.065524. ПМК 1774988 . ПМИД  17110484. 
  19. ^ Кеппен А, Кробич С, Томс Б, Вакернагель В (июль 1995 г.). «Взаимодействие с горячей точкой рекомбинации Chi in vivo превращает фермент RecBCD Escherichia coli в Chi-независимую рекомбиназу путем инактивации субъединицы RecD». Proc Natl Acad Sci США . 92 (14): 6249–53. Бибкод : 1995PNAS...92.6249K. дои : 10.1073/pnas.92.14.6249 . ПМК 41495 . ПМИД  7541534. 
  20. ^ Майерс Р.С., Кузьминов А., Шталь Ф.В. (июль 1995 г.). «Горячая точка рекомбинации Chi активирует рекомбинацию RecBCD, превращая Escherichia coli в мутантную фенокопию RecD». Proc Natl Acad Sci США . 92 (14): 6244–8. Бибкод : 1995PNAS...92.6244M. дои : 10.1073/pnas.92.14.6244 . ПМК 41494 . ПМИД  7603978. 
  21. ^ Бьянко П.Р., Брюэр Л.Р., Корзетт М., Бэлхорн Р., Йе Ю., Ковальчиковски С.К., Баскин Р.Дж. (январь 2001 г.). «Процессивная транслокация и раскручивание ДНК отдельными молекулами фермента RecBCD». Природа . 409 (6818): 374–8. Бибкод : 2001Natur.409..374B. дои : 10.1038/35053131. PMID  11201750. S2CID  4399125.

Внешние ссылки