stringtranslate.com

RecBCD

Экзодезоксирибонуклеаза V (EC 3.1.11.5, RecBCD, Экзонуклеаза V, экзонуклеаза V Escherichia coli , экзонуклеаза V E. coli , эндофермент гена recBC, дезоксирибонуклеаза RecBC, ДНКаза гена recBCD, ферменты гена recBCD ) — фермент E. coli , который инициирует рекомбинационную репарацию потенциально летальных двухцепочечных разрывов в ДНК , которые могут быть результатом ионизирующего излучения , ошибок репликации, эндонуклеаз , окислительного повреждения и множества других факторов. [2] [3] Фермент RecBCD является как геликазой , которая раскручивает или разделяет цепи ДНК, так и нуклеазой , которая делает одноцепочечные разрывы в ДНК. [1] Он катализирует экзонуклеолитическое расщепление (в присутствии АТФ) в направлении от 5′ к 3′ или от 3′ к 5′ с образованием 5′-фосфоолигонуклеотидов.

Структура

Ферментный комплекс состоит из трех различных субъединиц, называемых RecB, RecC и RecD, и поэтому комплекс называется RecBCD (рисунок 1). До открытия гена recD [ 4] фермент был известен как «RecBC». Каждая субъединица кодируется отдельным геном:

Функция

Рисунок 2. Путь гомологичной рекомбинации RecBCD, где АТФ находится в избытке.

Обе субъединицы RecD и RecB являются геликазами, т. е . энергозависимыми молекулярными моторами, которые раскручивают ДНК (или РНК в случае других белков). Субъединица RecB, кроме того, имеет функцию нуклеазы. [5] Наконец, фермент RecBCD (возможно, субъединица RecC) распознает определенную последовательность в ДНК, 5'- GCTGGTGG -3' , известную как Chi (иногда обозначаемую греческой буквой χ).

RecBCD необычен среди геликаз, поскольку имеет две геликазы, которые движутся с разной скоростью [6], и поскольку он может распознавать и изменяться последовательностью ДНК Chi. [7] [8] RecBCD активно связывается с концом линейной двухцепочечной (ds) ДНК. Хеликаза RecD движется по цепи с 5'-концом, на котором фермент инициирует раскручивание, а RecB — по цепи с 3'-концом. RecB медленнее, чем RecD, поэтому одноцепочечная (ss) петля ДНК накапливается перед RecB (рисунок 2). Это создает структуры ДНК с двумя ss-хвостами (более короткий 3'-концевой хвост и более длинный 5'-концевой хвост) и одной ss-петлей (на 3'-концевой цепи), наблюдаемыми с помощью электронной микроскопии. [9] ss-хвосты могут отжигаться, образуя вторую ss-петлю, комплементарную первой; Такие двухконтурные структуры изначально назывались «кроличьими ушами».

Механизм действия

Рисунок 3. Начало пути гомологичной рекомбинации RecBCD, где Mg 2+ находится в избытке.

Во время раскручивания нуклеаза в RecB может действовать по-разному в зависимости от условий реакции, в частности, от соотношения концентраций ионов Mg2 + и АТФ. (1) Если АТФ в избытке, фермент просто разрезает цепь с Chi (цепь с начальным 3'-концом) (рисунок 2). [10] [11] Раскручивание продолжается и производит 3'-ss-хвост с Chi вблизи его конца. Этот хвост может быть связан белком RecA, который способствует обмену цепями с неповрежденным гомологичным дуплексом ДНК. [12] Когда RecBCD достигает конца ДНК, все три субъединицы разбираются, и фермент остается неактивным в течение часа или более; [13] молекула RecBCD, действующая на Chi, не атакует другую молекулу ДНК. (2) Если ионы Mg2 + находятся в избытке, RecBCD расщепляет обе цепи ДНК эндонуклеолитически, хотя 5'-хвост расщепляется реже (рисунок 3). [14] Когда RecBCD встречает сайт Chi на 3'-концевой цепи, раскручивание приостанавливается, и переваривание 3'-хвоста снижается. [15] Когда RecBCD возобновляет раскручивание, он теперь расщепляет противоположную цепь ( т. е . 5'-хвост) [16] [17] и загружает белок RecA на 3'-концевую цепь. [12] После завершения реакции на одной молекуле ДНК фермент быстро атакует вторую ДНК, на которой происходят те же реакции, что и на первой ДНК.

Хотя ни одна из реакций не была подтверждена анализом внутриклеточной ДНК, из-за транзитной природы промежуточных продуктов реакции генетические данные указывают на то, что первая реакция более точно имитирует реакцию в клетках. [2] Например, активность Chi зависит от нуклеотидов на его 3'-стороне, как в клетках, так и в реакциях с избытком АТФ, но не с избытком Mg 2+ [PMID 27401752, 27330137]. Мутанты RecBCD, не имеющие обнаруживаемой экзонуклеазной активности, сохраняют высокую активность горячей точки Chi в клетках и разрыв Chi вне клеток. [18] Участок Chi на одной молекуле ДНК в клетках снижает или устраняет активность Chi на другой ДНК, возможно, отражая зависимую от Chi разборку RecBCD, наблюдаемую in vitro в условиях избытка АТФ и разрыва ДНК на Chi. [19] [20]

При обоих условиях реакции 3'-цепь остается нетронутой ниже по течению от Chi. Затем белок RecA активно загружается на 3'-хвост RecBCD. [12] В какой-то неопределенной точке RecBCD диссоциирует от ДНК, хотя RecBCD может раскручивать по крайней мере 60 кб ДНК без отпадания. RecA инициирует обмен цепочкой ДНК, с которой он связан, с идентичной или почти идентичной цепочкой в ​​интактном дуплексе ДНК; этот обмен цепями генерирует совместную молекулу ДНК, такую ​​как D-петля (рисунок 2). Считается, что совместная молекула ДНК разрешается либо путем репликации, инициированной вторгающейся 3'-концевой цепью, содержащей Chi, либо путем расщепления D-петли и образования соединения Холлидея. Соединение Холлидея может быть разрешено в линейную ДНК комплексом RuvABC или диссоциировано белком RecG. Каждое из этих событий может генерировать неповрежденную ДНК с новыми комбинациями генетических маркеров, по которым родительские ДНК могут отличаться. Этот процесс, гомологичная рекомбинация , завершает восстановление двухцепочечного разрыва ДНК.

Приложения

RecBCD — это модельный фермент для использования флуоресценции отдельных молекул в качестве экспериментальной методики, применяемой для лучшего понимания функции взаимодействия белка с ДНК. [21] Фермент также полезен для удаления линейной ДНК, как одноцепочечной, так и двухцепочечной, из препаратов кольцевой двухцепочечной ДНК, поскольку для его активности требуется конец ДНК.

Ссылки

  1. ^ ab Singleton MR, Dillingham MS, Gaudier M, Kowalczykowski SC, Wigley DB (ноябрь 2004 г.). «Кристаллическая структура фермента RecBCD раскрывает машину для обработки разрывов ДНК». Nature . 432 (7014): 187–93. Bibcode :2004Natur.432..187S. doi :10.1038/nature02988. PMID  15538360. S2CID  2916995.
  2. ^ ab Smith, GR (июнь 2012 г.). «Как фермент RecBCD и Chi способствуют восстановлению и рекомбинации разрывов ДНК: взгляд молекулярного биолога». Microbiol Mol Biol Rev. 76 ( 2): 217–28. doi :10.1128/MMBR.05026-11. PMC 3372252. PMID  22688812 . 
  3. ^ Spies M, Kowalczykowski SC (2003). "Гомологичная рекомбинация по путям RecBCD и RecF". В Higgins P (ред.). Бактериальные хромосомы . Вашингтон, округ Колумбия: ASM Press. стр. 389–403. ISBN 1-55581-232-5.
  4. ^ Amundsen SK, Taylor AF, Chaudhury AM, Smith GR (август 1986). "recD: ген для необходимой третьей субъединицы экзонуклеазы V". Proc Natl Acad Sci USA . 83 (15): 5558–62. Bibcode : 1986PNAS...83.5558A. doi : 10.1073 /pnas.83.15.5558 . PMC 386327. PMID  3526335. 
  5. ^ Yu M, Souaya J, Julin DA (февраль 1998 г.). «30-кДа C-концевой домен белка RecB имеет решающее значение для активности нуклеазы, но не для активности геликазы фермента RecBCD из Escherichia coli». Proc Natl Acad Sci USA . 95 (3): 981–6. Bibcode :1998PNAS...95..981Y. doi : 10.1073/pnas.95.3.981 . PMC 18645 . PMID  9448271. 
  6. ^ Taylor AF, Smith GR (июнь 2003 г.). «Фермент RecBCD — это ДНК-хеликаза с быстрыми и медленными моторами противоположной полярности». Nature . 423 (6942): 889–93. Bibcode :2003Natur.423..889T. doi :10.1038/nature01674. PMID  12815437. S2CID  4302346.
  7. ^ Taylor AF, Smith GR (июнь 1992 г.). «Фермент RecBCD изменяется при разрезании ДНК в горячей точке рекомбинации Chi». Proc Natl Acad Sci USA . 89 (12): 5226–30. Bibcode : 1992PNAS...89.5226T. doi : 10.1073/pnas.89.12.5226 . PMC 49264. PMID  1535156 . 
  8. ^ Amundsen SK, Taylor AF, Reddy M, Smith GR (декабрь 2007 г.). «Межсубъединичная сигнализация в ферменте RecBCD, сложной белковой машине, регулируемой горячими точками Chi». Genes Dev . 21 (24): 3296–307. doi :10.1101/gad.1605807. PMC 2113030. PMID  18079176 . 
  9. ^ Тейлор А., Смит GR (ноябрь 1980 г.). «Раскручивание и перекручивание ДНК ферментом RecBC». Cell . 22 (2 Pt 2): 447–57. doi :10.1016/0092-8674(80)90355-4. PMID  6256081. S2CID  22123298.
  10. ^ Ponticelli, AS; Schultz, DW; Taylor, AF; Smith, GR (май 1985). «Chi-зависимое расщепление цепи ДНК ферментом RecBC». Cell . 41 (1): 145–151. doi :10.1016/0092-8674(85)90069-8. PMID  3888404. S2CID  38361329.
  11. ^ Taylor AF, Schultz DW, Ponticelli AS, Smith GR (май 1985). "Низкий уровень фермента RecBC в сайтах Chi во время раскручивания ДНК: местоположение и зависимость разрезания от ориентации". Cell . 41 (1): 153–63. doi :10.1016/0092-8674(85)90070-4. PMID  3888405. S2CID  8551482.
  12. ^ abc Anderson DG, Kowalczykowski SC (июль 1997). «Транслоцирующий фермент RecBCD стимулирует рекомбинацию, направляя белок RecA на одноцепочечную ДНК регулируемым Chi образом». Cell . 90 (1): 77–86. doi : 10.1016/S0092-8674(00)80315-3 . PMID  9230304.
  13. ^ Taylor AF, Smith GR (апрель 1999). «Регулирование гомологичной рекомбинации: Chi инактивирует фермент RecBCD путем разборки трех субъединиц». Genes Dev . 13 (7): 890–900. doi :10.1101/gad.13.7.890. PMC 316601. PMID 10197988  . 
  14. ^ Dixon DA, Kowalczykowski SC (апрель 1993 г.). «Точка рекомбинации Chi — это регуляторная последовательность, которая действует путем ослабления нуклеазной активности фермента E. coli RecBCD». Cell . 73 (1): 87–96. doi :10.1016/0092-8674(93)90162-J. PMID  8384931. S2CID  19718817.
  15. ^ Spies M, Amitani I, Baskin RJ, Kowalczykowski SC (ноябрь 2007 г.). «Фермент RecBCD переключает ведущие моторные субъединицы в ответ на распознавание Chi». Cell . 131 (4): 694–705. doi :10.1016/j.cell.2007.09.023. PMC 2151923 . PMID  18022364. 
  16. ^ Taylor AF, Smith GR (октябрь 1995 г.). «Специфичность нитевидного надреза ДНК на участках Chi ферментом RecBCD. Модуляция уровнями АТФ и магния». J Biol Chem . 270 (41): 24459–67. doi : 10.1074/jbc.270.41.24459 . PMID  7592661.
  17. ^ Андерсон ДГ, Ковальчиковски СК (март 1997). «Горячая точка рекомбинации хи является регуляторным элементом, который переключает полярность деградации ДНК ферментом RecBCD». Genes Dev . 11 (5): 571–81. doi : 10.1101/gad.11.5.571 . PMID  9119222.
  18. ^ Амундсен SK, Смит GR (январь 2007 г.). «Активность точки Chi в Escherichia coli без экзонуклеазной активности RecBCD: последствия для механизма рекомбинации». Генетика . 175 (1): 41–54. doi :10.1534/genetics.106.065524. PMC 1774988 . PMID  17110484. 
  19. ^ Köppen A, Krobitsch S, Thoms B, Wackernagel W (июль 1995 г.). «Взаимодействие с горячей точкой рекомбинации Chi in vivo преобразует фермент RecBCD Escherichia coli в Chi-независимую рекомбиназу путем инактивации субъединицы RecD». Proc Natl Acad Sci USA . 92 (14): 6249–53. Bibcode :1995PNAS...92.6249K. doi : 10.1073/pnas.92.14.6249 . PMC 41495 . PMID  7541534. 
  20. ^ Myers RS, Kuzminov A, Stahl FW (июль 1995). "Горячая точка рекомбинации Chi активирует рекомбинацию RecBCD путем преобразования Escherichia coli в фенокопию мутанта recD". Proc Natl Acad Sci USA . 92 (14): 6244–8. Bibcode :1995PNAS...92.6244M. doi : 10.1073/pnas.92.14.6244 . PMC 41494 . PMID  7603978. 
  21. ^ Bianco PR, Brewer LR, Corzett M, Balhorn R, Yeh Y, Kowalczykowski SC, Baskin RJ (январь 2001 г.). «Процессивная транслокация и раскручивание ДНК отдельными молекулами фермента RecBCD». Nature . 409 (6818): 374–8. Bibcode :2001Natur.409..374B. doi :10.1038/35053131. PMID  11201750. S2CID  4399125.

Внешние ссылки