stringtranslate.com

Обратная транскриптаза

Обратная транскриптаза ( ОТ ) — это фермент, используемый для преобразования генома РНК в ДНК , процесс, называемый обратной транскрипцией . Обратные транскриптазы используются вирусами, такими как ВИЧ и гепатит В, для репликации своих геномов, ретротранспозоном мобильных генетических элементов для пролиферации в геноме хозяина и эукариотическими клетками для удлинения теломер на концах их линейных хромосом . Вопреки широко распространенному мнению, этот процесс не нарушает потоки генетической информации, описанные классической центральной догмой , поскольку передача информации от РНК к ДНК явно считается возможной. [2] [3] [4]

Ретровирусная ОТ имеет три последовательные биохимические активности: РНК-зависимая ДНК-полимеразная активность, рибонуклеаза H (РНКаза H) и ДНК-зависимая ДНК-полимеразная активность. В совокупности эти активности позволяют ферменту преобразовывать одноцепочечную РНК в двухцепочечную кДНК. В ретровирусах и ретротранспозонах эта кДНК затем может интегрироваться в геном хозяина, из которого могут быть сделаны новые копии РНК посредством транскрипции клетки хозяина . Та же последовательность реакций широко используется в лаборатории для преобразования РНК в ДНК для использования в молекулярном клонировании , секвенировании РНК , полимеразной цепной реакции (ПЦР) или анализе генома .

История

Обратные транскриптазы были открыты Говардом Темином в Университете Висконсин-Мэдисон в вирионах саркомы Рауса [5] и независимо выделены Дэвидом Балтимором в 1970 году в Массачусетском технологическом институте из двух РНК-вирусов опухолей: вируса лейкемии мышей и снова вируса саркомы Рауса . [6] За свои достижения они разделили Нобелевскую премию по физиологии и медицине 1975 года (с Ренато Дульбекко ).

Хорошо изученные обратные транскриптазы включают:

Функция в вирусах

Обратная транскриптаза показана с ее областями пальца, ладони и большого пальца. Каталитические аминокислоты активного центра РНКазы H и активного центра полимеразы показаны в форме шарика и палочки.

Ферменты кодируются и используются вирусами, которые используют обратную транскрипцию как этап в процессе репликации. Обратно-транскрибирующие РНК-вирусы , такие как ретровирусы , используют фермент для обратной транскрипции своих РНК- геномов в ДНК, которая затем интегрируется в геном хозяина и реплицируется вместе с ним. Обратно-транскрибирующие ДНК-вирусы , такие как гепаднавирусы , могут позволить РНК служить шаблоном при сборке и создании цепей ДНК. ВИЧ заражает людей с помощью этого фермента. Без обратной транскриптазы вирусный геном не смог бы встроиться в клетку хозяина, что привело бы к невозможности репликации. [ необходима цитата ]

Процесс обратной транскрипции или ретротранскрипции

Обратная транскриптаза создает двухцепочечную ДНК из шаблона РНК.

У видов вирусов с обратной транскриптазой, не обладающих ДНК-зависимой ДНК-полимеразной активностью, создание двухцепочечной ДНК, вероятно, может осуществляться кодируемой хозяином ДНК-полимеразой δ , которая ошибочно принимает вирусную ДНК-РНК за праймер и синтезирует двухцепочечную ДНК с помощью механизма, аналогичного удалению праймера , когда вновь синтезированная ДНК замещает исходную РНК-матрицу. [ необходима ссылка ]

Процесс обратной транскрипции, также называемый ретротранскрипцией или ретротрас, чрезвычайно подвержен ошибкам, и именно на этом этапе могут возникнуть мутации. Такие мутации могут вызывать лекарственную устойчивость .

Ретровирусная обратная транскрипция

Механизм обратной транскрипции в ВИЧ. Номера шагов не будут совпадать.

Ретровирусы , также называемые вирусами класса VI ssRNA-RT , являются вирусами с обратной транскрипцией РНК с промежуточным звеном ДНК. Их геномы состоят из двух молекул одноцепочечной РНК с положительным смыслом с 5'-кэпом и 3'-полиаденилированным хвостом . Примерами ретровирусов являются вирус иммунодефицита человека ( ВИЧ ) и Т-лимфотропный вирус человека ( HTLV ). Создание двухцепочечной ДНК происходит в цитозоле [10] в виде серии следующих шагов:

  1. Лизил- тРНК действует как праймер и гибридизуется с комплементарной частью генома вирусной РНК, называемой участком связывания праймера или PBS.
  2. Затем обратная транскриптаза добавляет нуклеотиды ДНК на 3'-конец праймера, синтезируя ДНК, комплементарную U5 (некодирующая область) и R-области (прямой повтор, обнаруженный на обоих концах молекулы РНК) вирусной РНК.
  3. Домен фермента обратной транскриптазы, называемый РНКазой Н, расщепляет области U5 и R на 5'-конце РНК.
  4. Затем праймер тРНК «перескакивает» на 3'-конец вирусного генома, а вновь синтезированные цепи ДНК гибридизуются с комплементарной R-областью РНК.
  5. Комплементарная ДНК (кДНК), добавленная в (2), дополнительно удлиняется.
  6. Большая часть вирусной РНК расщепляется РНКазой Н, оставляя только последовательность PP.
  7. Начинается синтез второй цепи ДНК с использованием оставшегося фрагмента PP вирусной РНК в качестве праймера.
  8. Праймер тРНК уходит и происходит «скачок». PBS из второй цепи гибридизуется с комплементарным PBS на первой цепи.
  9. Обе цепи удлиняются, образуя полную двухцепочечную копию ДНК исходного вирусного РНК-генома, которая затем может быть включена в геном хозяина с помощью фермента интегразы .

Создание двухцепочечной ДНК также включает перенос цепи , при котором происходит транслокация короткого продукта ДНК из начального РНК-зависимого синтеза ДНК в акцепторные шаблонные области на другом конце генома, которые позже достигаются и обрабатываются обратной транскриптазой для ее ДНК-зависимой активности ДНК. [11]

Ретровирусная РНК расположена от 5'-конца к 3'-концу. Место, где праймер отжигается с вирусной РНК, называется местом связывания праймера (PBS). РНК 5'-конец к сайту PBS называется U5, а РНК 3'-конец к PBS называется лидером. Праймер тРНК раскручивается между 14 и 22 нуклеотидами и образует спаренный по основанию дуплекс с вирусной РНК в PBS. Тот факт, что PBS расположен вблизи 5'-конца вирусной РНК, необычен, поскольку обратная транскриптаза синтезирует ДНК с 3'-конца праймера в направлении от 5' к 3' (относительно вновь синтезированной цепи ДНК). Поэтому праймер и обратная транскриптаза должны быть перемещены на 3'-конец вирусной РНК. Для осуществления этой перестановки необходимы многочисленные этапы и различные ферменты, включая ДНК-полимеразу , рибонуклеазу H (РНКазу H) и раскручивание полинуклеотида. [12] [13]

Обратная транскриптаза ВИЧ также обладает рибонуклеазной активностью, которая разрушает вирусную РНК во время синтеза кДНК, а также ДНК-зависимой ДНК-полимеразной активностью, которая копирует смысловую цепь кДНК в антисмысловую ДНК, образуя двухцепочечную промежуточную вирусную ДНК (вДНК). [14] Структурные элементы вирусной РНК ВИЧ регулируют ход обратной транскрипции. [15]

В клеточной жизни

Самовоспроизводящиеся участки эукариотических геномов, известные как ретротранспозоны, используют обратную транскриптазу для перемещения из одной позиции в геноме в другую через промежуточную РНК. Они в изобилии встречаются в геномах растений и животных. Теломераза — это еще одна обратная транскриптаза, обнаруженная во многих эукариотах, включая людей, которая несет свою собственную матрицу РНК ; эта РНК используется в качестве матрицы для репликации ДНК . [16]

Первые сообщения об обратной транскриптазе у прокариот появились еще в 1971 году во Франции ( Beljanski et al., 1971a, 1972) и несколько лет спустя в СССР ( Romashchenko 1977 [17] ). С тех пор они были широко описаны как часть бактериальных ретронов , отдельных последовательностей, которые кодируют обратную транскриптазу и используются в синтезе msDNA . Для того, чтобы инициировать синтез ДНК, необходим праймер. У бактерий праймер синтезируется во время репликации. [18]

Валериан Доля из штата Орегон утверждает, что вирусы, благодаря своему разнообразию, сыграли эволюционную роль в развитии клеточной жизни, при этом обратная транскриптаза играет центральную роль. [19]

Структура

Обратная транскриптаза использует «правую» структуру, похожую на ту, что обнаружена в других вирусных полимеразах нуклеиновых кислот . [20] [21] В дополнение к функции транскрипции, ретровирусные обратные транскриптазы имеют домен, принадлежащий к семейству РНКазы H , который жизненно важен для их репликации. Разрушая шаблон РНК, он позволяет синтезировать другую цепь ДНК. [22] Некоторые фрагменты из переваривания также служат в качестве праймера для ДНК-полимеразы (либо того же фермента, либо белка-хозяина), ответственного за создание другой (плюс) цепи. [20]

точность репликации

В течение жизненного цикла ретровируса существуют три различные системы репликации. Первый процесс — это синтез вирусной ДНК с помощью обратной транскриптазы из вирусной РНК, которая затем формирует новые комплементарные цепи ДНК. Второй процесс репликации происходит, когда клеточная ДНК-полимераза хозяина реплицирует интегрированную вирусную ДНК. Наконец, РНК-полимераза II транскрибирует провирусную ДНК в РНК, которая будет упакована в вирионы. Мутация может произойти во время одного или всех этих этапов репликации. [23]

Обратная транскриптаза имеет высокий уровень ошибок при транскрипции РНК в ДНК, поскольку, в отличие от большинства других ДНК-полимераз , она не имеет возможности корректирования . Этот высокий уровень ошибок позволяет мутациям накапливаться с ускоренной скоростью по сравнению с корректированными формами репликации. Коммерчески доступные обратные транскриптазы, производимые Promega, указаны в их руководствах как имеющие уровень ошибок в диапазоне 1 на 17 000 оснований для AMV и 1 на 30 000 оснований для M-MLV. [24]

Помимо создания однонуклеотидных полиморфизмов , обратные транскриптазы также участвуют в таких процессах, как слияние транскриптов, перетасовка экзонов и создание искусственных антисмысловых транскриптов. [25] [26] Было высказано предположение, что эта активность переключения шаблонов обратной транскриптазы, которую можно полностью продемонстрировать in vivo , могла быть одной из причин обнаружения нескольких тысяч неаннотированных транскриптов в геномах модельных организмов. [27]

Переключение шаблонов

Два РНК- генома упакованы в каждую ретровирусную частицу, но после заражения каждый вирус генерирует только один провирус . [28] После заражения обратная транскрипция сопровождается переключением шаблона между двумя копиями генома (рекомбинация с выбором копии). [28] Существуют две модели, которые предполагают, почему РНК-транскриптаза переключает шаблоны. Первая, модель принудительного выбора копии, предполагает, что обратная транскриптаза изменяет шаблон РНК, когда она сталкивается с надрезом, подразумевая, что рекомбинация обязательна для поддержания целостности вирусного генома. Вторая, модель динамического выбора, предполагает, что обратная транскриптаза изменяет шаблоны, когда функция РНКазы и функция полимеразы не синхронизированы по скорости, подразумевая, что рекомбинация происходит случайным образом и не является ответом на повреждение генома. Исследование Rawson et al. подтвердило обе модели рекомбинации. [28] От 5 до 14 событий рекомбинации на геном происходит в каждом цикле репликации. [29] Переключение шаблонов (рекомбинация) по-видимому необходимо для поддержания целостности генома и как механизм восстановления для спасения поврежденных геномов. [30] [28]

Приложения

Молекулярная структура зидовудина (АЗТ), препарата, используемого для ингибирования обратной транскриптазы

Противовирусные препараты

Поскольку ВИЧ использует обратную транскриптазу для копирования своего генетического материала и создания новых вирусов (часть цикла распространения ретровируса), были разработаны специальные препараты, чтобы нарушить этот процесс и тем самым подавить его рост. В совокупности эти препараты известны как ингибиторы обратной транскриптазы и включают в себя аналоги нуклеозидов и нуклеотидов зидовудин (торговое название Retrovir), ламивудин (Epivir) и тенофовир (Viread), а также ненуклеозидные ингибиторы, такие как невирапин (Viramune). [ необходима цитата ]

Молекулярная биология

Обратная транскриптаза обычно используется в исследованиях для применения метода полимеразной цепной реакции к РНК в технике, называемой обратной транскрипцией полимеразной цепной реакцией (ОТ-ПЦР). Классический метод ПЦР может быть применен только к цепям ДНК , но с помощью обратной транскриптазы РНК может быть транскрибирована в ДНК, что делает возможным ПЦР- анализ молекул РНК. Обратная транскриптаза также используется для создания библиотек кДНК из мРНК . Коммерческая доступность обратной транскриптазы значительно улучшила знания в области молекулярной биологии, поскольку, наряду с другими ферментами , она позволила ученым клонировать, секвенировать и характеризовать РНК.

Смотрите также

Ссылки

  1. ^ PDB : 3KLF ; Tu X, Das K, Han Q, Bauman JD, Clark AD, Hou X, Frenkel YV, Gaffney BL, Jones RA, Boyer PL, Hughes SH, Sarafianos SG, Arnold E (октябрь 2010 г.). «Структурная основа устойчивости ВИЧ-1 к AZT путем удаления». Nature Structural & Molecular Biology . 17 (10): 1202–9. doi :10.1038/nsmb.1908. PMC  2987654. PMID  20852643 .
  2. ^ Крик Ф. (август 1970 г.). «Центральная догма молекулярной биологии». Nature . 227 (5258): 561–3. Bibcode :1970Natur.227..561C. doi :10.1038/227561a0. PMID  4913914. S2CID  4164029.
  3. ^ Саркар С. (1996). Философия и история молекулярной биологии: новые перспективы . Дордрехт: Kluwer Academic Publishers. С. 187–232.
  4. ^ Danchin É, Pocheville A, Rey O, Pujol B, Blanchet S (2019). «Эпигенетически облегченная мутационная ассимиляция: эпигенетика как центр в инклюзивном эволюционном синтезе». Biological Reviews . 94 (1): 259–282. doi : 10.1111/brv.12453 . PMC 6378602 . S2CID  67861162. 
  5. ^ Temin HM, Mizutani S (июнь 1970). «РНК-зависимая ДНК-полимераза в вирионах вируса саркомы Рауса». Nature . 226 (5252): 1211–3. doi :10.1038/2261211a0. PMID  4316301. S2CID  4187764.
  6. ^ Baltimore D (июнь 1970). «РНК-зависимая ДНК-полимераза в вирионах РНК-вирусов опухолей». Nature . 226 (5252): 1209–11. doi :10.1038/2261209a0. PMID  4316300. S2CID  4222378.
  7. ^ Ferris AL, Hizi A, Showalter SD, Pichuantes S, Babe L, Craik CS, Hughes SH (апрель 1990 г.). «Иммунологический и протеолитический анализ структуры обратной транскриптазы ВИЧ-1» (PDF) . Вирусология . 175 (2): 456–64. doi :10.1016/0042-6822(90)90430-y. PMID  1691562.
  8. ^ ab Konishi A, Yasukawa K, Inouye K (июль 2012 г.). «Улучшение термической стабильности α-субъединицы обратной транскриптазы вируса миелобластоза птиц с помощью направленного мутагенеза» (PDF) . Biotechnology Letters . 34 (7): 1209–15. doi :10.1007/s10529-012-0904-9. hdl : 2433/157247 . PMID  22426840. S2CID  207096569.
  9. ^ Autexier C, Lue NF (июнь 2006 г.). «Структура и функция обратной транскриптазы теломеразы». Annual Review of Biochemistry . 75 (1): 493–517. doi :10.1146/annurev.biochem.75.103004.142412. PMID  16756500.
  10. ^ Bio-Medicine.org - Ретровирус Получено 17 февраля 2009 г.
  11. ^ Telesnitsky A, Goff SP (1993). "Перенос цепи с сильным стоп-кодоном во время обратной транскрипции". В Skalka MA, Goff SP (ред.). Обратная транскриптаза (1-е изд.). Нью-Йорк: Cold Spring Harbor. стр. 49. ISBN 978-0-87969-382-4.
  12. ^ Бернстайн А., Вайс Р., Тузе Дж. (1985). «РНК-содержащие опухолевые вирусы». Молекулярная биология опухолевых вирусов (2-е изд.). Колд-Спринг-Харбор, Нью-Йорк: Лаборатория Колд-Спринг-Харбор.
  13. ^ Moelling K, Broecker F (апрель 2015 г.). «Обратная транскриптаза-РНКаза H: от вирусов к противовирусной защите». Annals of the New York Academy of Sciences . 1341 (1): 126–35. Bibcode : 2015NYASA1341..126M. doi : 10.1111/nyas.12668. PMID  25703292. S2CID  42378727.
  14. ^ Kaiser GE (январь 2008 г.). "Жизненный цикл ВИЧ". Домашняя страница микробиологии доктора Кайзера . Общественный колледж Балтимора. Архивировано из оригинала 26.07.2010.
  15. ^ Крупкин М., Джексон Л.Н., Ха Б., Пуглиси ЕВ. (декабрь 2020 г.). «Достижения в понимании инициации обратной транскрипции ВИЧ-1». Curr Opin Struct Biol . 65 : 175–183. doi : 10.1016/j.sbi.2020.07.005. PMC 9973426. PMID 32916568.  S2CID 221636459  . 
  16. ^ Кригер М., Скотт М.П., ​​Мацудайра ПТ., Лодиш Х.Ф., Дарнелл Дж.Э., Зипурски Л., Кайзер С., Берк А. (2004). Молекулярная клеточная биология . Нью-Йорк: WH Freeman and CO. ISBN 978-0-7167-4366-8.
  17. ^ Ромащенко А.Г. и др. (1977). «Отделение от препаратов ДНК-полимераз и РНК-зависимой ДНК-полимераз; оболочка и свойства фермента». Известия Академии наук СССР . 233 : 734–737.
  18. ^ Hurwitz J, Leis JP (январь 1972). «РНК-зависимая ДНК-полимеразная активность РНК-вирусов опухолей. I. Направляющее влияние ДНК на реакцию». Журнал вирусологии . 9 (1): 116–29. doi :10.1128/JVI.9.1.116-129.1972. PMC 356270. PMID  4333538 . 
  19. ^ Арнольд С. (17 июля 2014 г.). «Могут ли гигантские вирусы стать источником жизни на Земле?». National Geographic . Архивировано из оригинала 18 июля 2014 г. Получено 29 мая 2016 г.
  20. ^ ab Sarafianos SG, Marchand B, Das K, Himmel DM, Parniak MA, Hughes SH, Arnold E (январь 2009 г.). «Структура и функция обратной транскриптазы ВИЧ-1: молекулярные механизмы полимеризации и ингибирования». Журнал молекулярной биологии . 385 (3): 693–713. doi :10.1016/j.jmb.2008.10.071. PMC 2881421. PMID  19022262 . 
  21. ^ Hansen JL, Long AM, Schultz SC (август 1997). «Структура РНК-зависимой РНК-полимеразы полиовируса». Structure . 5 (8): 1109–22. doi : 10.1016/S0969-2126(97)00261-X . PMID  9309225.
  22. ^ Schultz SJ, Champoux JJ (июнь 2008 г.). «Активность РНКазы H: структура, специфичность и функция в обратной транскрипции». Virus Research . 134 (1–2): 86–103. doi :10.1016/j.virusres.2007.12.007. PMC 2464458 . PMID  18261820. 
  23. ^ Bbenek K, Kunkel AT (1993). "Точность ретровирусных обратных транскриптаз". В Skalka MA, Goff PS (ред.). Обратная транскриптаза . Нью-Йорк: Cold Spring Harbor Laboratory Press. стр. 85. ISBN 978-0-87969-382-4.
  24. ^ "Инструкция по эксплуатации набора Promega" (PDF) . 1999. Архивировано из оригинала (PDF) 21.11.2006.
  25. ^ Houseley J, Tollervey D (август 2010 г.). «Очевидный неканонический транс-сплайсинг генерируется обратной транскриптазой in vitro». PLOS ONE . ​​5 (8): e12271. Bibcode :2010PLoSO...512271H. doi : 10.1371/journal.pone.0012271 . PMC 2923612 . PMID  20805885. 
  26. ^ Zeng XC, Wang SX (июнь 2002 г.). «Доказательства того, что BmTXK бета-BmKCT cDNA из китайского скорпиона Buthus martensii Karsch является артефактом, полученным в процессе обратной транскрипции». FEBS Letters . 520 (1–3): 183–4, ответ автора 185. doi : 10.1016/S0014-5793(02)02812-0 . PMID  12044895. S2CID  24619868.
  27. ^ van Bakel H, Nislow C, Blencowe BJ, Hughes TR (2011). «Ответ на «Реальность всепроникающей транскрипции»». PLOS Biology . 9 (7): e1001102. doi : 10.1371/journal.pbio.1001102 . PMC 3134445 . 
  28. ^ abcd Rawson JM, Nikolaitchik OA, Keele BF, Pathak VK, Hu WS (ноябрь 2018 г.). «Рекомбинация необходима для эффективной репликации ВИЧ-1 и поддержания целостности вирусного генома». Nucleic Acids Research . 46 (20): 10535–10545. doi :10.1093/nar/gky910. PMC 6237782. PMID  30307534 . 
  29. ^ Кромер Д., Гримм А. Дж., Шлаб ТЕ., Мак Дж., Дэвенпорт М. П. (январь 2016 г.). «Оценка скорости переключения шаблонов ВИЧ и рекомбинации in vivo». AIDS . 30 (2): 185–92. doi : 10.1097/QAD.00000000000000936 . PMID  26691546. S2CID  20086739.
  30. ^ Hu WS, Temin HM (ноябрь 1990 г.). «Ретровирусная рекомбинация и обратная транскрипция». Science . 250 (4985). Нью-Йорк, Нью-Йорк: 1227–33. Bibcode :1990Sci...250.1227H. doi :10.1126/science.1700865. PMID  1700865.

Внешние ссылки