Внутренняя , или rho-независимая терминация , представляет собой процесс, сигнализирующий об окончании транскрипции и высвобождении вновь построенной молекулы РНК . У бактерий, таких как E. coli , транскрипция завершается либо rho-зависимым, либо rho-независимым процессом. При Rho-зависимом процессе rho-белок находит и связывает сигнальную последовательность в мРНК и подает сигнал о расщеплении. Напротив, внутренняя терминация не требует специального белка для подачи сигнала о терминации и контролируется специфическими последовательностями РНК. Когда начинается процесс терминации, транскрибируемая мРНК образует стабильную шпильку вторичной структуры, также известную как « стебель-петля» . За этой шпилькой РНК следуют несколько нуклеотидов урацила. Связи между урацилом (rU) и аденином (dA) очень слабые. Белок, связанный с РНК-полимеразой (nusA), достаточно прочно связывается со структурой «стебель-петля», что приводит к временной остановке полимеразы. Эта пауза полимеразы совпадает с транскрипцией полиурациловой последовательности. Слабые связи аденин-урацил снижают энергию дестабилизации дуплекса РНК-ДНК, позволяя ему раскручиваться и диссоциировать от РНК-полимеразы. В целом, именно модифицированная структура РНК завершает транскрипцию.
Структуры «стебель-петля», за которыми не следует полиурациловая последовательность, заставляют РНК-полимеразу останавливаться, но обычно она продолжает транскрипцию через короткое время, поскольку дуплекс слишком стабилен, чтобы раскрутиться достаточно далеко, чтобы вызвать терминацию.
Rho-независимая терминация транскрипции является частым механизмом, лежащим в основе активности цис -действующих регуляторных элементов РНК, таких как рибопереключатели .
Целевая функция внутренней терминации состоит в передаче сигнала о диссоциации тройного комплекса элонгации (TEC) , завершающего транскрипт. Внутренняя терминация не зависит от белка Rho , в отличие от Rho-зависимой терминации, при которой бактериальный белок Rho входит и действует на РНК-полимеразу, вызывая ее диссоциацию. [1] Здесь нет дополнительного белка, и транскрипт образует собственную петлеобразную структуру. Таким образом, внутренняя терминация также регулирует уровень транскрипции, определяя, сколько полимераз может транскрибировать ген за определенный период времени, и может помочь предотвратить взаимодействие с соседними хромосомами. [1]
Сам процесс регулируется как положительными, так и отрицательными факторами завершения, обычно за счет модификации структуры шпильки. Это достигается за счет взаимодействия с одноцепочечной РНК, которая соответствует области выше петли, что приводит к нарушению процесса терминации. Более того, существует некоторое предположение, что участок ореха также может способствовать регуляции, поскольку он участвует в рекрутировании некоторых критических компонентов при формировании шпильки. [2]
При внутренней терминации транскрипт РНК удваивает обратную связь и пары оснований сам с собой, создавая структуру « стебель-петля» РНК , или шпильку. Эта структура имеет решающее значение для высвобождения как транскрипта, так и полимеразы в конце транскрипции. [3] В живых клетках ключевыми компонентами являются сама стабильная стволовая петля, а также последовательность из 6-8 остатков урацила , которые следуют за ней. [3] Стебель обычно состоит из 8-9 пар оснований, в основном гуанина и цитозина (GC), а петля состоит из 4-8 остатков. Считается, что стволовая часть структуры необходима для терминации транскрипции, а петля — нет. [4] Об этом свидетельствует тот факт, что завершение может быть достигнуто в неродных структурах, которые не включают цикл. [5]
Стержневая часть шпильки обычно богата парами оснований GC. Пары оснований GC обладают значительными взаимодействиями при штабелировании оснований и могут образовывать три водородные связи друг с другом, что делает их очень термодинамически выгодными. И наоборот, хотя богатая урацилом последовательность, следующая за шпилькой, не всегда необходима для терминации, [6] предполагается, что богатая урацилом последовательность способствует внутреннему терминированию, поскольку связь UA не так сильна, как связи GC. [4] Эта присущая нестабильность кинетически способствует диссоциации транскрипта РНК. [4]
Чтобы определить оптимальную длину стебля, исследователи изменили его длину и наблюдали, как быстро происходит терминация. [3] Когда длина стебля удлинялась или укорачивалась по сравнению со стандартной длиной в 8-9 пар оснований, терминация была менее эффективной, а если изменения были достаточно большими, терминация прекращалась полностью. [3]
Эксперименты показали, что если присутствует олигонуклеотидная последовательность, которая идентична нижележащей части стебля, она образует пару оснований с вышестоящей частью. [5] Это создает структуру, аналогичную исходной структуре «стебель-петля», но в конце отсутствует цикл. Без присутствия цикла внутреннее завершение все равно может произойти. [5] Это указывает на то, что цикл не является необходимым для внутреннего завершения. [ нужна цитата ]
Как правило, отсутствие богатой урацилом последовательности после «стебель-петля» приводит к задержке или паузе в транскрипции, но терминация не прекращается полностью. [6]
Внутреннее терминирование осуществляется сигналами, непосредственно закодированными в ДНК и РНК. Сигнал появляется в виде шпильки, за которым следуют 8 уридинов на 3'-конце. Это приводит к быстрой диссоциации комплекса элонгации. Шпилька инактивирует и дестабилизирует TEC, ослабляя взаимодействия в сайте связывания РНК-ДНК и других сайтах, которые удерживают этот комплекс вместе. Пауза, вызванная растяжением урацилов, важна и дает время для образования шпильки. В отсутствие U-тракта образование шпилек не приводит к эффективному терминации, что указывает на его важность в этом процессе. [7]
Процесс дестабилизации удлинения происходит в четыре этапа [7]
Что касается ингибиторов внутренней терминации, многое еще неизвестно. Одним из немногих известных примеров является белок бактериофага 7. Он состоит из крио-ЭМ структур 3.4A и 4.0A P7-NusA-TEC и P7-TEC. [8] Этот белок бактериофага 7 останавливает терминацию транскрипции, блокируя канал выхода из РНК РНК-полимеразы (РНКП) и препятствуя образованию шпильки РНК на внутреннем терминаторе. Более того, белок бактериофага 7 ингибирует движения зажимов РНКП. [8] Укорочение С-концевой полуспирали РНКП несколько снижает ингибирующую активность. Эти движения зажима РНКП были нацелены на некоторые другие ингибиторы бактериальной РНКП. К этим ингибиторам относятся миксопиронин , кораллопиронин и рипостатин. Они действуют путем ингибирования изомеризации. [8]
РНК-полимеразы во всех трех доменах жизни имеют ту или иную версию факторно-независимой терминации. Все они используют полиурациловые пути, хотя точные механизмы и дополнительные последовательности различаются. У архей и эукариотов шпилька, по-видимому, не требуется. [9]
Транскрипция архей имеет общие эукариотические и бактериальные связи. С эукариотами он имеет сходство со своими факторами инициации, которые помогают транскрипции идентифицировать соответствующие последовательности, такие как гомологи ТАТА-бокса , а также факторы, которые поддерживают элонгацию транскрипции. Однако для осуществления всего процесса необходимы дополнительные факторы транскрипции, аналогичные тем, которые обнаружены у бактерий. [9]
Что касается терминации транскрипции, геном архей уникален тем, что он чувствителен как к внутренней терминации, так и к фактор-зависимой терминации. Биоинформатический анализ показал, что примерно половина генов и оперонов у архей организуются в сигналы или содержат сигналы внутренней терминации. [10] РНК-полимераза архей реагирует на внутренние сигналы как in vivo , так и in vitro, такие как участки, богатые поли-U. Однако, в отличие от внутренней терминации бактерий, не требуется никакой конкретной структуры РНК или шпильки. Окружающая среда и другие факторы генома все еще могут влиять на прекращение. [10]
Факторозависимая терминация у архей также отличается от факторзависимой терминации у бактерий. [9] Фактор терминации aCASP1 (также известный как FttA) распознает регионы, богатые поли-U, вероятно, сотрудничая с «внутренним» режимом для достижения более эффективной терминации. [11]
РНК-полимераза III осуществляет «внутреннюю» терминацию. Большинство генов, транскрибируемых РНКП III, имеют поли(дТ)-участок. Однако, хотя поли(дТ) приостанавливает каждую РНК-полимеразу, одного этого не может быть достаточно; какой-то другой механизм должен дестабилизировать зажим. В RNAP III некоторые сайты поли(dT) действительно иногда считываются: некоторые гены имеют несколько таких участков, что позволяет производить транскрипты разной длины. [12]
Нестабильность гибридов rU:dA, вероятно, важна для терминации с помощью RNAP III. Функционально важны части основных субъединиц С1 и С2, а также «субкомплексы» С53/37 и С11. Ряд внешних факторов может изменить поведение завершения. [12]