SOLiD (секвенирование путем лигирования и обнаружения олигонуклеотидов) — это технология секвенирования ДНК нового поколения, разработанная Life Technologies и доступная для коммерческого использования с 2006 года. Эта технология нового поколения генерирует 10 8 - 10 9 небольших считываний последовательностей за один раз. Она использует 2-основное кодирование для декодирования необработанных данных, сгенерированных платформой секвенирования, в данные последовательностей.
Этот метод не следует путать с «секвенированием путем синтеза», принципом, используемым в пиросеквенировании Roche-454 (введено в 2005 году, в 2009 году получены миллионы прочтений по 200-400 п.н.), и системой Solexa (теперь принадлежащей Illumina) (введено в 2006 году, в 2009 году получены сотни миллионов прочтений по 50-100 п.н.)
Эти методы снизили стоимость с 0,01 долл. США за основание в 2004 г. до почти 0,0001 долл. США за основание в 2006 г. и увеличили производительность секвенирования с 1 000 000 оснований на машину в день в 2004 г. до более чем 5 000 000 000 оснований на машину в день в 2009 г. Существует более 30 публикаций, описывающих его использование сначала для позиционирования нуклеосом от Валуева и др. [1], транскрипционного профилирования или чувствительного к цепям РНК-Seq с Клунаном и др. [2], транскрипционного профилирования отдельных клеток с Тангом и др. [3] и, в конечном итоге, повторного секвенирования человека с МакКернаном и др. [4].
Сообщается, что метод, используемый этой машиной (секвенирование путем лигирования), имеет некоторые проблемы с секвенированием палиндромных последовательностей. [5]
Библиотека фрагментов ДНК готовится из образца, который необходимо секвенировать, и используется для подготовки популяций клонированных гранул. То есть на поверхности каждой магнитной гранулы будет присутствовать только один вид фрагмента. Фрагменты, прикрепленные к магнитным гранулам, будут иметь универсальную последовательность адаптера P1, так что начальная последовательность каждого фрагмента будет известна и идентична. Эмульсионная ПЦР проводится в микрореакторах, содержащих все необходимые реагенты для ПЦР. Гранулы с полученными продуктами ПЦР помещаются на предметное стекло.
Праймеры гибридизуются с последовательностью адаптера P1 в шаблоне библиотеки. Набор из четырех флуоресцентно меченых двухосновных зондов конкурирует за лигирование с праймером секвенирования. Специфичность двухосновного зонда достигается путем опроса каждого 1-го и 2-го основания в каждой реакции лигирования. Выполняются множественные циклы лигирования, обнаружения и расщепления, причем количество циклов определяет конечную длину считывания. После серии циклов лигирования продукт удлинения удаляется, а шаблон переустанавливается с праймером, комплементарным положению n-1, для второго раунда циклов лигирования.
Для каждой метки последовательности выполняется пять раундов сброса праймера. В процессе сброса праймера каждое основание опрашивается в двух независимых реакциях лигирования двумя разными праймерами. Например, основание в позиции считывания 5 анализируется праймером номер 2 в цикле лигирования 2 и праймером номер 3 в цикле лигирования 1.
По данным ABI, платформа SOLiD 3plus выдает 60 гигабаз пригодных для использования данных ДНК за один запуск. Благодаря двухосновной системе кодирования в технологию встроена внутренняя проверка точности, которая обеспечивает точность 99,94%. Химия систем также означает, что ей не мешают гомополимеры, в отличие от системы Roche 454 FLX, и поэтому большие и сложные области повторения гомополимеров больше не являются проблемой для секвенирования.
Естественно, эта технология будет использоваться для секвенирования ДНК, но из-за высокой параллельности всех технологий следующего поколения они также найдут применение в транскриптомике и эпигеномике .
Микрочипы были основой транскриптомики в течение последних десяти лет, и технология на основе матриц впоследствии распространилась на другие области. Однако они ограничены тем, что информацию можно получить только для зондов, которые находятся на чипе. Можно получить информацию только для организмов, для которых доступны чипы, и они сопровождаются всеми проблемами гибридизации большого количества молекул (различные температуры гибридизации). Транскриптомика РНК-Seq с помощью секвенирования следующего поколения будет означать, что эти барьеры больше не актуальны. Весь транскриптом любого организма может быть потенциально секвенирован за один запуск (для очень маленьких бактериальных геномов), и будет доступна не только идентификация каждого транскрипта, но и профилирование экспрессии, поскольку также могут быть достигнуты количественные считывания.
Иммунопреципитация хроматина (ChIP) — это метод определения сайтов связывания факторов транскрипции и ДНК-белковых взаимодействий. В прошлом он с некоторым успехом сочетался с технологией массивов (ChIP-chip). В этой области также может применяться секвенирование следующего поколения. Иммунопреципитация метилированием (MeDIP) также может быть выполнена и на массивах.
Возможность узнать больше о метилировании и сайтах связывания ТФ в масштабах всего генома является ценным ресурсом и может многому нас научить о болезнях и молекулярной биологии в целом.