В фармакологии регрессионный анализ Шильда , основанный на уравнении Шильда , названном в честь Хайнца Отто Шильда , является инструментом для изучения влияния агонистов и антагонистов на реакцию , вызванную рецептором , или на связывание лиганд-рецептор.
Кривые «доза-реакция» могут быть построены для описания ответа или образования комплекса лиганд-рецептор в зависимости от концентрации лиганда. Антагонисты затрудняют образование этих комплексов, ингибируя взаимодействие лиганда с его рецептором. Это рассматривается как изменение кривой доза-эффект: обычно сдвиг вправо или понижение максимума. Обратимый конкурентный антагонист должен вызывать сдвиг вправо кривой доза-эффект, так что новая кривая будет параллельна старой, а максимум не изменится. Это связано с тем, что обратимые конкурентные антагонисты являются преодолимыми антагонистами. Величину сдвига вправо можно определить количественно с помощью коэффициента дозы r. Отношение доз r представляет собой отношение дозы агониста, необходимой для полумаксимального ответа при наличии антагониста, к дозе агониста, необходимой для полумаксимального ответа без антагониста («контроль»). Другими словами, соотношение EC50 ингибированных и неингибированных кривых. Таким образом, r представляет собой как силу антагониста, так и концентрацию примененного антагониста. Уравнение, полученное на основе уравнения Гаддума, можно использовать для связи r с следующим образом:
где
График Шильда представляет собой двойной логарифмический график, обычно в виде ординаты и абсциссы . Это делается путем логарифма по основанию 10 обеих частей предыдущего уравнения после вычитания 1:
Это уравнение линейно относительно , что позволяет легко строить графики без вычислений. Это было особенно ценно до того, как использование компьютеров в фармакологии стало широко распространенным. Пересечение оси Y в уравнении представляет собой отрицательный логарифм и может использоваться для количественной оценки силы антагониста.
Эти эксперименты необходимо проводить в очень широком диапазоне (следовательно, в логарифмическом масштабе), поскольку механизмы различаются в больших масштабах, например, при высоких концентрациях лекарства. [ нужна цитата ]
Подгонку графика Шильда к наблюдаемым точкам данных можно выполнить с помощью регрессионного анализа .
Хотя в большинстве экспериментов в качестве меры эффекта используется клеточный ответ, эффект, по сути, является результатом кинетики связывания; Итак, чтобы проиллюстрировать механизм, используется связывание лиганда . Лиганд А будет связываться с рецептором R в соответствии с константой равновесия:
Хотя константа равновесия более значима, в текстах часто упоминается ее обратная константа, константа сродства (K aff = k 1 /k -1 ): лучшее связывание означает увеличение сродства связывания.
Уравнение связывания простого лиганда с одним гомогенным рецептором:
Это уравнение Хилла-Лэнгмюра, которое практически представляет собой уравнение Хилла, описанное для связывания агониста. В химии эта зависимость называется уравнением Ленгмюра , которое описывает адсорбцию молекул на участках поверхности (см. Адсорбция ).
— общее количество мест связывания, а при построении уравнения — это горизонтальная асимптота, к которой стремится график; По мере увеличения концентрации лиганда будет занято больше сайтов связывания, но 100%-ная заселенность никогда не будет. Сродство связывания представляет собой концентрацию, необходимую для занятия 50% сайтов; чем ниже это значение, тем легче лиганду занять место связывания.
Связывание лиганда с рецептором в равновесном состоянии следует той же кинетике, что и фермент в устойчивом состоянии ( уравнение Михаэлиса-Ментен ), без превращения связанного субстрата в продукт.
Агонисты и антагонисты могут оказывать различное влияние на связывание лиганда. Они могут изменить максимальное количество сайтов связывания, сродство лиганда к рецептору, оба эффекта вместе или даже более причудливые эффекты, когда изучаемая система более интактна, например, в образцах тканей. (Поглощение тканей, десенсибилизация и другие неравновесные состояния могут быть проблемой.)
Преодолимый препарат меняет аффинность связывания:
Непреодолимый препарат меняет максимальное связывание:
Регрессия Шильда также может выявить наличие более одного типа рецепторов и показать, был ли эксперимент проведен неправильно, поскольку система не достигла равновесия.
Первый радиорецепторный анализ (RRA) был проведен в 1970 году Лефковицем и др. [ сомнительно ] с использованием меченого радиоактивным изотопом гормона для определения аффинности связывания с его рецептором. [1]
Радиорецепторный анализ требует отделения связанного лиганда от свободного. Это делается путем фильтрации , центрифугирования или диализа . [2]
Методом, который не требует разделения, является сцинтилляционный анализ близости , который основан на том факте, что β-лучи от 3 H проходят чрезвычайно короткие расстояния. Рецепторы связаны с шариками, покрытыми полигидроксисцинтиллятором. Обнаруживаются только связанные лиганды.
Сегодня метод флуоресценции предпочтительнее радиоактивных материалов из-за гораздо более низкой стоимости, меньшей опасности и возможности мультиплексирования реакций с высокой производительностью. Одна из проблем заключается в том, что лиганды, меченные флуоресцентной меткой, должны нести объемистый флуорофор, который может препятствовать связыванию лиганда. Поэтому используемый флуорофор, длину линкера и его положение необходимо тщательно выбирать.
Примером может служить использование FRET , где флуорофор лиганда передает свою энергию флуорофору антитела, выработанного против рецептора.
Другие методы обнаружения, такие как поверхностный плазмонный резонанс, даже не требуют флуорофоров.