Секвенирование путем лигирования — это метод секвенирования ДНК , который использует фермент ДНК-лигазу для идентификации нуклеотида , присутствующего в заданной позиции в последовательности ДНК. В отличие от большинства популярных в настоящее время методов секвенирования ДНК, этот метод не использует ДНК-полимеразу для создания второй цепи. Вместо этого чувствительность фермента ДНК-лигазы к несоответствиям используется для определения базовой последовательности целевой молекулы ДНК.
ДНК-лигаза — это фермент , который соединяет концы молекул ДНК. Хотя обычно ее представляют как соединение двух пар концов одновременно, как при лигировании фрагментов рестриктаз , лигаза также может соединять концы только на одной из двух цепей (например, когда другая цепь уже непрерывна или не имеет концевого фосфата , необходимого для лигирования). ДНК-лигаза чувствительна к структуре ДНК и имеет очень низкую эффективность, когда есть несоответствия между основаниями двух цепей.
Секвенирование методом лигирования основано на чувствительности ДНК-лигазы к несовпадениям пар оснований. Целевая молекула для секвенирования представляет собой одну цепочку неизвестной последовательности ДНК, фланкированную по крайней мере с одного конца известной последовательностью. Для связывания известной последовательности вводится короткая «якорная» цепочка.
Затем вводится смешанный пул зондовых олигонуклеотидов (длиной восемь или девять оснований), помеченных (обычно флуоресцентными красителями) в соответствии с положением, которое будет секвенировано. Эти молекулы гибридизуются с целевой последовательностью ДНК, следующей за якорной последовательностью, и ДНК-лигаза предпочтительно присоединяет молекулу к якорю, когда ее основания соответствуют неизвестной последовательности ДНК. На основе флуоресценции, производимой молекулой, можно сделать вывод об идентичности нуклеотида в этом положении в неизвестной последовательности.
Олигонуклеотидные зонды также могут быть сконструированы с расщепляемыми связями, которые могут быть расщеплены после идентификации метки. Это позволит удалить метку и регенерировать 5'-фосфат на конце лигированного зонда, подготавливая систему к следующему раунду лигирования. Этот цикл можно повторить несколько раз, чтобы прочитать более длинные последовательности. [1] Это секвенирует каждое N-ое основание, где N — длина зонда, оставшегося после расщепления. Чтобы секвенировать пропущенные позиции, якорь и лигированные олигонуклеотиды могут быть отделены от целевой последовательности ДНК, и другой раунд секвенирования путем лигирования начинается с якоря на одно или несколько оснований короче.
Более простая, хотя и более ограниченная, методика заключается в проведении повторных раундов одного лигирования, где метка соответствует разным позициям в зонде, с последующим снятием якоря и лигированного зонда. [2] [3]
Секвенирование путем лигирования может осуществляться в любом направлении (5'-3' или 3'-5') в зависимости от того, какой конец олигонуклеотидов зонда заблокирован меткой. Направление 3'-5' более эффективно для выполнения нескольких циклов лигирования. Обратите внимание, что это направление противоположно методам секвенирования на основе полимеразы.
Сообщалось, что при секвенировании методом лигирования возникают проблемы с секвенированием палиндромных последовательностей. [4]
{{cite journal}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка ){{cite journal}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка )