Серийный проход

Последовательный пассаж — это итерационный процесс выращивания бактерий или вирусов . Например, вирус можно вырастить в одной среде, а затем часть этой популяции вируса можно удалить и поместить в новую среду. Этот процесс повторяется с любым количеством стадий, а затем изучается конечный продукт, часто в сравнении с исходным вирусом.

Этот вид облегченной передачи часто проводится в лабораторных условиях, поскольку представляет научный интерес наблюдать, как передаваемый вирус или бактерия развивается в ходе эксперимента. В частности, серийный пассаж может быть весьма полезен в исследованиях, направленных на изменение вирулентности вируса или другого патогена . Одним из следствий этого является то, что серийный пассаж может быть полезен при создании вакцин , поскольку ученые могут применить серийный пассаж и создать штамм возбудителя, который имеет низкую вирулентность, но имеет иммуногенность , сравнимую с исходным штаммом. ^[1] Это также может привести к созданию более трансмиссивных штаммов в дополнение к более низкой вирулентности, о чем свидетельствует пассаж A/ H5N1 у хорьков. ^[2]

Механизм

Последовательный пассаж может быть выполнен либо in vitro , либо in vivo . В методе in vitro вирус или штамм бактерий выделяют и дают расти в течение определенного времени. После того, как образец вырастет за это время, часть его будет перенесена в новую среду и оставлена расти в течение такого же периода. ^[3]^[4] Этот процесс будет повторяться столько раз, сколько необходимо.

В качестве альтернативы можно провести эксперимент in vivo, в котором животное инфицировано патогеном, и этому патогену дается время для роста в этом хозяине, прежде чем его образец будет удален от хозяина и передан другому хозяину. Этот процесс повторяется для определенного количества хостов; индивидуальный эксперимент определяет это число.

Когда серийный пассаж проводится in vitro или in vivo, вирус или бактерия могут эволюционировать путем неоднократной мутации . Выявление и изучение возникающих мутаций часто позволяет получить информацию об изучаемом вирусе или бактерии. Соответственно, после выполнения серийного пассажа может оказаться полезным сравнить полученный вирус или образец бактерий с оригиналом, отмечая любые произошедшие мутации и их коллективные эффекты. Могут произойти различные важные результаты. Вирулентность вируса может измениться ^[5] или вирус может эволюционировать и адаптироваться к среде, отличной от той, в которой он обычно находится. ^[5] Для того чтобы вызвать заметные изменения в вирусе, необходимо относительно небольшое количество пассажей; например, вирус обычно может адаптироваться к новому хозяину примерно за десять пассажей. ^[5]

Поскольку серийный пассаж обеспечивает быструю эволюцию вируса к хозяину, его можно использовать для изучения эволюции устойчивости к антибиотикам; в частности, для определения того, какие мутации могут привести к развитию устойчивости к антибиотикам. ^[6]

История

Техника последовательного прохождения существует примерно с 1800-х годов. В частности, примером этого метода является работа Луи Пастера над вакциной против бешенства в конце 1800-х годов. ^[7]

За свою жизнь Пастер создал несколько вакцин. Его работа до появления бешенства включала ослабление патогенов, но не путем последовательного прохождения. В частности, Пастер работал с холерой и обнаружил, что, если он будет культивировать бактерии в течение длительного периода времени, он сможет создать эффективную вакцину. ^[7]^[8] Пастер считал, что в кислороде есть что-то особенное, и именно поэтому он смог ослабить (создать менее вирулентную версию) бактерий. Пастер также пытался применить этот метод для создания вакцины от сибирской язвы , хотя и с меньшим успехом. ^[7]

Далее Пастер хотел применить этот метод для создания вакцины от бешенства. Однако бешенство, без его ведома, было вызвано вирусом, а не бактериальным патогеном, таким как холера и сибирская язва, и по этой причине бешенство нельзя было культивировать таким же способом, как холеру и сибирскую язву. ^[8] Методы серийного пассажа вирусов in vitro не были разработаны до 1940-х годов, когда Джон Эндерс , Томас Хакл Веллер и Фредерик Роббинс разработали для этого технику. Эти три учёных впоследствии получили Нобелевскую премию за свои важные достижения. ^[9]

Чтобы решить эту проблему, Пастер работал с вирусом бешенства in vivo. ^[7]^[8] В частности, он взял ткань мозга у инфицированной собаки и трансплантировал ее другой собаке, повторяя этот процесс несколько раз и, таким образом, осуществляя серийный пассаж у собак. ^[7] Эти попытки увеличили вирулентность вируса. ^[7] Затем он понял, что можно поместить собачью ткань в обезьяну, чтобы заразить ее, а затем провести серийный пассаж на обезьянах. ^[7] Завершив этот процесс и заразив полученным вирусом собаку, Пастер понял, что вирус менее вирулентен. ^[7] В основном Пастер работал с вирусом бешенства у кроликов. ^[8] В конечном итоге, чтобы создать вакцину от бешенства, Пастер использовал простой метод, который включал высушивание тканей. Как описано в его записной книжке:

В ряде колб, в которых воздух поддерживается в сухом состоянии… каждый день суспендируют кусок свежей ткани позвоночника кролика, взятой у кролика, умершего от бешенства. Кроме того, каждый день собаке вводят под кожу 1 мл стерилизованного бульона, в котором растворен небольшой фрагмент одного из этих высушенных кусков позвоночника, начиная с куска, наиболее удаленного по времени от времени, когда над ним работали, в чтобы убедиться, что он совсем не заразен. ^[7]

Для создания своих вакцин Пастер в основном использовал и другие методы, помимо серийного пассажа. Однако идея ослабления вируса путем последовательного прохождения все еще актуальна.

Использование в вакцинах

Один из способов ослабить передачу вируса хозяину — передать вирус другому виду. ^[5] Идея состоит в том, что по мере того, как штамм вируса становится более адаптированным к другому виду, этот штамм становится менее адаптированным к исходному хозяину, тем самым снижая вирулентность по отношению к исходному хозяину. ^[5] Это неявный принцип, которым неосознанно воспользовался Луи Пастер, когда передал вирус бешенства обезьянам и в итоге получил вирус, менее опасный, например, для собак. ^[7]

В результате серийного пассажа получается живая вакцина . В этом есть как преимущества, так и недостатки. В частности, живые вакцины иногда более эффективны и более долговечны, чем инактивированные или другие типы вакцин. ^[10]^[11] Однако, так же, как вирус эволюционировал и стал аттенуированным, он может обратно развиваться в организме хозяина, что приводит к заражению. ^[11]

Эксперименты

Исследователи провели множество экспериментов с использованием серийного пассажа. Некоторые из экспериментальных применений серийного пассажа включают изменение вирулентности вируса, изучение адаптивной эволюции или потенциальной эволюции зоонозных заболеваний к новым хозяевам, а также изучение устойчивости к антибиотикам .

Повышение вирулентности для использования в моделировании животных

При разработке вакцин против вирусов упор делается на ослабление вируса или снижение его вирулентности для данного хозяина. Иногда полезно использовать серийный пассаж для повышения вирулентности вируса. Обычно при серийном пассаже определенного вида в результате получается вирус, более вирулентный для этого вида. ^[5]

Например, в одном исследовании ^[12] серийный пассаж на павианах использовался для создания штамма ВИЧ-2, который особенно вирулентен для павианов. Типичные штаммы ВИЧ-2 заражают павианов медленно. ^[12] Эта специфика затрудняет использование ВИЧ-2 на животных моделях ВИЧ-1, поскольку у животных в модели симптомы проявляются медленно. Однако более вирулентный штамм ВИЧ-2 может быть полезен для использования на животных моделях. ^[12]

Другое исследование Канты Суббаро включало эксперимент по серийному пассажу, в ходе которого мыши были заражены атипичной пневмонией . ^[13] SARS обычно не вызывает у мышей особого заболевания, однако после того, как вирус подвергся серийному заражению мышей, он стал смертельным. ^[13]

Изменение вирулентности атипичной пневмонии таким образом было важно, поскольку без вирулентной формы атипичной пневмонии для заражения лабораторных животных ученые не смогли бы проверить действие атипичной пневмонии на животной модели. ^[13]

В более общем плане этот эксперимент также отражает общий медицинский принцип: вирулентность вируса определяется трудностью его передачи.

Как правило, если вирус убивает своего хозяина слишком быстро, у него не будет возможности вступить в контакт с другими хозяевами и передать вирус перед смертью. При серийном пассаже, когда вирус передавался от хозяина к хозяину независимо от его вирулентности, как в эксперименте Суббаро, отбираются вирусы, которые растут быстрее всего (и, следовательно, являются наиболее вирулентными). ^[13]

Этот принцип имеет значение для общественного здравоохранения, поскольку предполагает, что в очень густонаселенных или перенаселенных районах, таких как трущобы или места группового карантина , естественный отбор может благоприятствовать более вирулентным вирусам.

Это также помогает объяснить, почему хорошая гигиена так важна. Хорошая гигиена защищает от высоковирулентных вирусов, снижая способность патогенов передаваться. ^[13]

Последовательное пассирование использовалось для получения адаптированного к мышам SARS-CoV-2. ^[14]

Грипп

Вирус H5N1 является особо смертоносным штаммом гриппа . В настоящее время он может заразить человека, но не заразен между людьми. Тем не менее, известно, что более 600 человек во всем мире умерли от вируса H5N1, передающегося животными, ^[13] , поэтому возможность передачи вируса вызывает серьезную озабоченность у ученых.

Было проведено несколько экспериментов по серийному пассажу, чтобы определить возможность передачи вируса человеку. В частности, Рон Фушье и его коллеги провели 10-шаговый эксперимент по серийному пассажу на хорьках. ^[13] При этом они создали штамм гриппа, который не только заражал хорьков, но и передавался между хорьками. ^[13] Примечательно, что этот штамм был очень похож на исходный штамм, которым они заразили первого хорька — другими словами, потребовалось лишь несколько мутаций, чтобы вирус стал передаваться между хорьками. ^[13]^[15] Точно так же исследователь Ёсихиро Каваока обнаружил, что для передачи вируса хорькам необходима единственная мутация. ^[15]

И исследования Фушье, и исследования Каваоки изначально подверглись цензуре из-за их последствий для биотерроризма . ^[15] Исследование было позже опубликовано, но осталось спорным. ^[15]

Серийный пассаж — это искусственный метод, который используется в лабораторных условиях, а не естественный процесс. Соответственно, вероятность того, что вирус H5N1 действительно мутирует и станет передаваться человеку, неизвестна; однако исследователь Дерек Смит создал эволюционную модель, чтобы показать, что это возможно. ^[13]

Понимание того, как вирусы передаются между видами

Другое применение серийного пассажа — понимание того, как патогены адаптируются к новым видам. Внедряя патоген в новый вид хозяина и выполняя серийный пассаж, ученые могут наблюдать, как патоген адаптируется к новому хозяину, и точно определять мутации, которые обеспечивают эту адаптацию. ^[5]