Саузерн-блоттинг — это метод, используемый для обнаружения и количественной оценки определенной последовательности ДНК в образцах ДНК. Этот метод используется в молекулярной биологии . Вкратце, очищенная ДНК из биологического образца (например, крови или ткани) расщепляется ферментами рестрикции , и полученные фрагменты ДНК разделяются электрофорезом с использованием электрического тока для перемещения их через подобный ситу гель или матрицу, что позволяет меньшим фрагментам двигаться быстрее, чем более крупным. Фрагменты ДНК переносятся из геля или матрицы на твердую мембрану, которая затем подвергается воздействию ДНК-зонда, меченого радиоактивной, флуоресцентной или химической меткой. Метка позволяет визуализировать любые фрагменты ДНК, содержащие комплементарные последовательности с последовательностью ДНК-зонда в Саузерн-блоте. [1]
Саузерн-блоттинг сочетает в себе перенос фрагментов ДНК, разделенных электрофорезом, на мембрану фильтра в процессе, называемом блоттингом , и последующее обнаружение фрагментов с помощью гибридизации зондов . [2]
Метод назван в честь британского биолога Эдвина Саузерна , который впервые опубликовал его в 1975 году. [3] Другие методы блоттинга (например, вестерн-блот , [4] нозерн-блот , восточный блот , юго-западный блот ), которые используют схожие принципы, но с использованием РНК или белка, позже были названы в честь направлений компаса как своего рода каламбур от имени Саузерна. Поскольку название является эпонимом , Саузерн пишется с заглавной буквы, как это принято у имен собственных . Названия других методов блоттинга могут следовать этому соглашению по аналогии. [5]
История
Саузерн изобрел Саузерн-блоттинг после объединения трех инноваций. Первая из них — это эндонуклеазы рестрикции, которые были разработаны в Университете Джонса Хопкинса Томом Келли и Гамильтоном Смитом . Эти эндонуклеазы рестрикции используются для разрезания ДНК в определенной последовательности. Кеннет и Норин Мюррей представили эту технику как Саузерн. Вторая инновация — это гель-электрофорез, основанный на разделении смесей ДНК, РНК или белков в соответствии с размером молекул, который также был разработан в Университете Джонса Хопкинса Дэниелом Натансом и Кэтлин Данной в 1971 году. Третья инновация — это метод сквозного блоттинга, который был разработан Фредериком Сэнгером , когда он перенес молекулы РНК на бумагу DEAE. Саузерн-блоттинг был изобретен в 1973 году, но опубликован он был только в 1975 году. Хотя он был опубликован позже, метод получил распространение, когда Саузерн представил технику Саузерн-блоттинга ученому из лаборатории Колд-Спринг-Харбор по имени Майкл Мэтьюз, нарисовав эту технику на бумаге. [6]
Метод
Геномная ДНК расщепляется одним или несколькими рестриктазами, затем фрагменты ДНК фракционируются по размеру с помощью гель-электрофореза. Перед тем, как фрагменты ДНК переносятся на твердую мембрану, которая является нейлоновой или нитроцеллюлозной мембраной, их сначала денатурируют щелочной обработкой. [7] После того, как фрагменты ДНК иммобилизованы на мембране, используются методы прегибридизации для уменьшения неспецифического связывания зондов. Затем фрагменты на мембране гибридизуются с радиоактивно мечеными или нерадиоактивно мечеными ДНК, РНК или олигонуклеотидными зондами, которые комплементарны целевой последовательности ДНК. Затем используются методы обнаружения для визуализации целевой ДНК. [8]
Выделение ДНК: ДНК для исследования выделяется из различных тканей. Наиболее подходящим источником ДНК является ткань крови. Однако ее можно выделить из различных тканей (волосы, сперма, слюна и т. д.).
Расщепление ДНК: Рестрикционные эндонуклеазы используются для разрезания высокомолекулярных цепей ДНК на более мелкие фрагменты. Это делается путем добавления желаемого количества ДНК, которое может быть изменено в соответствии с используемым зондом и сложностью ДНК, с рестриктазой, буфером фермента и очищенной водой. Затем все инкубируется при 37 °C в течение ночи.
Электрофорез в геле: Затем фрагменты ДНК подвергаются электрофорезу на агарозном геле для разделения по размеру. Если некоторые фрагменты ДНК больше 15 кб , то перед блоттингом гель можно обработать кислотой, например, разбавленной HCl . Это депуринирует фрагменты ДНК, разбивая ДНК на более мелкие части, тем самым обеспечивая более эффективный перенос из геля в мембрану.
Денатурация: Если используются щелочные методы переноса, ДНК-гель помещают в щелочной раствор (обычно содержащий гидроксид натрия ) для денатурации двухцепочечной ДНК. Денатурация в щелочной среде может улучшить связывание отрицательно заряженных остатков тимина ДНК с положительно заряженными аминогруппами мембраны, разделяя ее на отдельные нити ДНК для последующей гибридизации с зондом (см. ниже), и разрушает любую остаточную РНК, которая все еще может присутствовать в ДНК. Выбор щелочных методов переноса вместо нейтральных, однако, часто является эмпирическим и может привести к эквивалентным результатам. [ необходима цитата ]
Блоттинг: Лист нитроцеллюлозной (или, альтернативно, нейлоновой ) мембраны помещается поверх (или ниже, в зависимости от направления переноса) геля. К гелю постоянно прикладывается давление (либо с помощью всасывания, либо путем размещения стопки бумажных полотенец и груза поверх мембраны и геля), чтобы обеспечить хороший и равномерный контакт между гелем и мембраной. При переносе всасыванием используется 20X SSC буфер для обеспечения герметизации и предотвращения высыхания геля. Затем буферный перенос капиллярным действием из области высокого водного потенциала в область низкого водного потенциала (обычно фильтровальная бумага и бумажные салфетки) используется для перемещения ДНК из геля на мембрану; ионообменные взаимодействия связывают ДНК с мембраной из-за отрицательного заряда ДНК и положительного заряда мембраны. Для переноса фрагментов ДНК на твердую мембрану можно использовать пять методов: [8]
Восходящий капиллярный перенос: этот метод переносит фрагмент ДНК вверх из геля к мембране, где поток жидкости или буфера будет направлен вверх.
Капиллярный перенос вниз: этот метод осуществляется путем помещения геля на поверхность мембраны (обычно нейлоновой заряженной мембраны), а фрагменты ДНК переносятся в направлении вниз с потоком щелочного буфера.
Одновременный перенос на две мембраны: этот метод используется для одновременного переноса фрагментов ДНК высокой концентрации из геля на две мембраны.
Электрофоретический перенос: этот метод обычно использует большой электрический ток, что затрудняет эффективный перенос ДНК из-за температуры используемого буфера, поэтому эти машины могут быть либо оснащены охлаждающими устройствами, либо использоваться в холодном помещении.
Вакуумный перенос: этот метод использует буфер из верхней камеры для переноса ДНК из геля на нитроцеллюлозную или нейлоновую мембрану, гель помещается непосредственно на мембрану, а мембрана помещается на пористый экран в вакуумной камере.
Иммобилизация: Затем мембрану запекают в вакуумной или обычной печи при температуре 80 °C в течение 2 часов (стандартные условия; нитроцеллюлозная или нейлоновая мембрана) или подвергают воздействию ультрафиолетового излучения (нейлоновая мембрана) для постоянного прикрепления перенесенной ДНК к мембране.
Гибридизация: После этого гибридизационный зонд — одиночный фрагмент ДНК с определенной последовательностью, присутствие которой в целевой ДНК должно быть установлено — подвергается воздействию мембраны. Зондовая ДНК маркируется так, чтобы ее можно было обнаружить, обычно путем включения радиоактивности или мечения молекулы флуоресцентным или хромогенным красителем . В некоторых случаях гибридизационный зонд может быть изготовлен из РНК, а не ДНК. Чтобы гарантировать специфичность связывания зонда с образцом ДНК, наиболее распространенные методы гибридизации используют ДНК спермы лосося или сельди для блокирования поверхности мембраны и целевой ДНК, деионизированный формамид и детергенты, такие как SDS, для уменьшения неспецифического связывания зонда.
Детекция: После гибридизации избыток зонда смывается с мембраны (обычно с использованием буфера SSC ), и картина гибридизации визуализируется на рентгеновской пленке методом авторадиографии в случае радиоактивного или флуоресцентного зонда или путем проявления цвета на мембране, если используется хромогенный метод детекции.
Интерпретация результатов
Гибридизация зонда с определенным фрагментом ДНК на мембране фильтра указывает на то, что этот фрагмент содержит последовательность ДНК, которая комплементарна зонду. Этап переноса ДНК из электрофорезного геля на мембрану позволяет легко связывать меченый гибридизационный зонд с фракционированной по размеру ДНК. Он также позволяет фиксировать гибриды мишень-зонд, необходимые для анализа с помощью авторадиографии или других методов обнаружения. Саузерн-блоты, выполненные с геномной ДНК, расщепленной рестриктазой, могут использоваться для определения количества последовательностей (например, копий гена) в геноме . Зонд, который гибридизуется только с одним сегментом ДНК, который не был разрезан рестриктазой, даст одну полосу на Саузерн-блоте, тогда как, вероятно, будут наблюдаться несколько полос, когда зонд гибридизуется с несколькими очень похожими последовательностями (например, теми, которые могут быть результатом дупликации последовательности). Для улучшения специфичности и снижения гибридизации зонда с последовательностями, которые менее чем на 100% идентичны, параметры гибридизации могут быть изменены (например, путем повышения температуры гибридизации или снижения содержания соли). Нейлоновая мембрана более долговечна и имеет более высокую связывающую способность с фрагментами ДНК, чем нитроцеллюлозная мембрана, поэтому фрагменты ДНК будут более прочно зафиксированы на мембране, даже если мембрана инкубируется при высоких температурах. Кроме того, по сравнению с нитроцеллюлозной мембраной, которой требуется буфер с высокой ионной силой для связывания фрагментов ДНК с мембраной, нейлоновые заряженные мембраны используют буферы с очень низкой ионной силой для переноса даже небольших фрагментов ДНК размером около 50 п.н. на мембрану, обычно переносимая ДНК разделяется полиакриламидным гелем. На этапе блоттинга наиболее эффективным методом переноса ДНК из геля на мембрану является вакуумный перенос, поскольку он переносит ДНК быстрее и количественно. [8]
Приложения
Перенос методом саузерн-блоттинга может использоваться для гомологичного клонирования на основе аминокислотной последовательности белкового продукта целевого гена. Олигонуклеотиды разрабатываются таким образом, чтобы они были комплементарны целевой последовательности. Олигонуклеотиды синтезируются химически, радиоактивно маркируются и используются для скрининга библиотеки ДНК или других коллекций клонированных фрагментов ДНК. Последовательности, которые гибридизуются с гибридизационным зондом, далее анализируются, например, для получения полной последовательности целевого гена.
С помощью этого метода можно изучать нормальную хромосомную или генную перестройку. [7]
Может использоваться для поиска похожих последовательностей у других видов или в геноме путем снижения специфичности гибридизации. [7]
В смеси, содержащей различные размеры переваренной ДНК, ее используют для идентификации рестрикционного фрагмента определенного размера. [7]
Он полезен для выявления изменений, происходящих в генах, включая вставки, перестройки, делеции и точечные мутации , которые влияют на сайты рестрикции. [7]
Более того, он используется для идентификации определенного региона, который использует много различных рестриктаз в рестрикционном картировании. Также он используется для определения того, какой сайт распознавания был изменен из-за полиморфизма одного нуклеотида , который изменяет определенный рестриктаз. [7]
Саузерн-блоттинг также может использоваться для идентификации метилированных участков в определенных генах. Особенно полезны рестриктазы MspI и HpaII , обе из которых распознают и расщепляют в пределах одной и той же последовательности. Однако HpaII требует, чтобы C в пределах этого участка был метилирован, тогда как MspI расщепляет только ДНК, не метилированную в этом участке. Следовательно, любые метилированные участки в пределах последовательности, проанализированной с помощью определенного зонда, будут расщеплены первым, но не вторым ферментом. [9]
Может использоваться для идентификации личности посредством дактилоскопии и диагностики заболеваний. [10]
Ограничения
По сравнению с другими тестами, Саузерн-блоттинг представляет собой сложную методику, состоящую из нескольких этапов, для которых требуется дорогостоящее оборудование и реагенты. [10]
Необходимы высококачественные и большие объемы ДНК. [10]
Саузерн-блоттинг – это трудоемкий метод, который позволяет лишь оценить размер ДНК, поскольку является полуколичественным методом. [10]
Его нельзя использовать для обнаружения мутаций на уровне пар оснований. [10]
^ "Talking Glossary of Genetic Terms | NHGRI". www.genome.gov . Национальные институты здравоохранения . Получено 24 января 2023 г. . В данной статье использован текст из этого источника, находящегося в общественном достоянии .
^ «Южное пятно».
^ Саузерн, Эдвин Меллор (5 ноября 1975 г.). «Обнаружение специфических последовательностей среди фрагментов ДНК, разделенных гель-электрофорезом». Журнал молекулярной биологии . 98 (3): 503–517. doi :10.1016/S0022-2836(75)80083-0. ISSN 0022-2836. PMID 1195397. S2CID 20126741.
^ Towbin; Staehelin, T; Gordon, J; et al. (1979). «Электрофоретический перенос белков из полиакриламидных гелей в нитроцеллюлозные листы: процедура и некоторые приложения». PNAS . 76 (9): 4350–4. Bibcode :1979PNAS...76.4350T. doi : 10.1073/pnas.76.9.4350 . PMC 411572 . PMID 388439.
^ Бернетт, В. Нил (апрель 1981 г.). «Вестерн-блоттинг: электрофоретический перенос белков из гелей додецилсульфата натрия-полиакриламида в немодифицированную нитроцеллюлозу и радиографическое обнаружение с антителами и радиоактивным йодированным белком А». Аналитическая биохимия . 112 (2): 195–203. doi :10.1016/0003-2697(81)90281-5. ISSN 0003-2697. PMID 6266278.
^ Тофано, Дейдри; Вихерс, Ильза Р.; Кук-Диган, Роберт (15 августа 2006 г.). «Эдвин Саузерн, ДНК-блоттинг и технология микрочипов: пример меняющейся роли патентов в академической молекулярной биологии». Геномика, общество и политика . 2 (2). doi : 10.1186/1746-5354-2-2-50 . ISSN 1746-5354. PMC 5424904 .
^ abcdef Гленн, Гэри; Андреу, Лефкотеа-Василики (2013-01-01), «Глава пятая — Анализ ДНК методом Саузерн-блоттинга», в Lorsch, Jon (ред.), DNA, т. 529, Academic Press, стр. 47–63, doi :10.1016/b978-0-12-418687-3.00005-7, ISBN9780124186873, PMID 24011036 , получено 2023-01-04
^ abc Green, Michael R.; Sambrook, Joseph (июль 2021 г.). «Анализ ДНК методом Саузерн-блоттинга». Cold Spring Harbor Protocols . 2021 (7): pdb.top100396. doi : 10.1101/pdb.top100396 . ISSN 1940-3402. PMID 34210774. S2CID 235710916.
^ Биохимия 3-е издание, Мэтьюз, Ван Хольд и др., Addison Wesley Publishing, стр. 977
.jpg/1280px-Recombinant_DNA-_southern_blot_(1).jpg)
В данной статье использован текст из этого источника, находящегося в общественном достоянии .