Двумерная спектроскопия ядерного магнитного резонанса ( 2D ЯМР ) представляет собой набор методов спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР), которые дают данные, нанесенные на график в пространстве, определяемом двумя частотными осями, а не одной. Типы 2D ЯМР включают корреляционную спектроскопию (COSY), J-спектроскопию , обменную спектроскопию (EXSY) и спектроскопию ядерного эффекта Оверхаузера (NOESY). Двумерные спектры ЯМР предоставляют больше информации о молекуле, чем одномерные спектры ЯМР, и особенно полезны при определении структуры молекулы , особенно для молекул, которые слишком сложны для работы с использованием одномерного ЯМР.
Первый двумерный эксперимент, COSY, был предложен Жаном Джинером , профессором Свободного университета Брюсселя, в 1971 году. Этот эксперимент позже был реализован Уолтером П. Ауэ, Энрико Бартольди и Ричардом Р. Эрнстом , опубликовавшими свою работу. в 1976 году. [1] [2] [3]
Каждый эксперимент состоит из последовательности радиочастотных (РЧ) импульсов с периодами задержки между ними. Время, частота и интенсивность этих импульсов отличают различные эксперименты ЯМР друг от друга. [4] Почти все двумерные эксперименты состоят из четырех этапов: подготовительный период, когда когерентность намагничивания создается с помощью набора радиочастотных импульсов; период эволюции - определенный промежуток времени, в течение которого импульсы не подаются и ядерным спинам разрешено свободно прецессировать (вращаться); период смешивания, когда когерентность управляется другой серией импульсов до состояния, которое даст наблюдаемый сигнал; и период обнаружения, в течение которого сигнал затухания свободной индукции от образца наблюдается как функция времени, аналогично одномерному FT-ЯМР. [5]
Два измерения двумерного эксперимента ЯМР представляют собой две оси частот, представляющие химический сдвиг. Каждая ось частоты связана с одной из двух переменных времени, которыми являются продолжительность периода развития ( время развития ) и время, прошедшее в течение периода обнаружения ( время обнаружения ). Каждый из них преобразуется из временного ряда в частотный ряд посредством двумерного преобразования Фурье . Одиночный двумерный эксперимент генерируется как серия одномерных экспериментов с различным удельным временем эволюции в последовательных экспериментах, при этом в каждом эксперименте регистрируется вся длительность периода обнаружения. [5]
Конечным результатом является график, показывающий значение интенсивности для каждой пары частотных переменных. Интенсивность пиков спектра можно представить в третьем измерении. Чаще всего интенсивность обозначается с помощью контурных линий или разных цветов.
В этих методах перенос намагниченности происходит между ядрами одного типа за счет J-связи ядер, соединенных несколькими связями.
Первым и наиболее популярным экспериментом по двумерному ЯМР является последовательность гомоядерной корреляционной спектроскопии (COSY), которая используется для идентификации связанных друг с другом спинов. Он состоит из одного РЧ-импульса (p1), за которым следует определенное время развития (t1), за которым следует второй импульс (p2), за которым следует период измерения (t2). [6]
Двумерный спектр, полученный в результате эксперимента COSY, показывает частоты одного изотопа , чаще всего водорода ( 1 H), вдоль обеих осей. (Также были разработаны методы генерации спектров гетероядерной корреляции, в которых две оси соответствуют различным изотопам, таким как 13 C и 1 H.) Диагональные пики соответствуют пикам в эксперименте 1D-ЯМР, а перекрестные пики указывают на связи между парами ядер (так же, как расщепление мультиплета указывает на связь в 1D-ЯМР). [6]
Перекрестные пики возникают в результате явления, называемого переносом намагниченности , и их наличие указывает на то, что два ядра связаны, которые имеют два разных химических сдвига, которые составляют координаты перекрестного пика. Каждая связь дает два симметричных перекрестных пика выше и ниже диагонали. То есть кросс-пик возникает тогда, когда имеется корреляция между сигналами спектра по каждой из двух осей при этих значениях. Простой визуальный способ определить, какие связи представляет собой перекрестный пик, — это найти диагональный пик, который находится непосредственно над или под перекрестным пиком, и другой диагональный пик, который находится непосредственно слева или справа от перекрестного пика. Ядра, представленные этими двумя диагональными пиками, связаны. [6]
COSY-90 — самый распространенный УЮТНЫЙ эксперимент. В COSY-90 импульс p1 наклоняет ядерный спин на 90°. Еще один представитель семейства COSY — COSY-45 . В COSY-45 вместо импульса 90° для второго импульса p2 используется импульс 45°. Преимущество COSY-45 заключается в том, что диагональные пики менее выражены, что упрощает сопоставление перекрестных пиков вблизи диагонали в большой молекуле. Кроме того, относительные знаки констант связи (см. J-coupling#Magnitude of J-coupling ) могут быть выяснены из спектра COSY-45. Это невозможно при использовании COSY-90. [7] В целом, COSY-45 предлагает более чистый спектр, тогда как COSY-90 более чувствителен.
Другой родственный метод COSY — это COSY с двойной квантовой фильтрацией (DQF). DQF COSY использует метод выбора когерентности, такой как циклическое изменение фазы или градиенты импульсного поля , которые заставляют только сигналы двухквантовой когерентности давать наблюдаемый сигнал. Это приводит к уменьшению интенсивности диагональных пиков и изменению формы их линий от широкой «дисперсионной» формы линии к более резкой «поглощающей» форме линии. Он также устраняет диагональные пики от несвязанных ядер. Все они имеют то преимущество, что дают более чистый спектр, в котором диагональные пики не затеняют перекрестные пики, которые слабее в обычном COSY-спектре. [8]
Эксперимент TOCSY аналогичен эксперименту COSY тем, что наблюдаются перекрестные пики связанных протонов. Однако кросс-пики наблюдаются не только для ядер, непосредственно связанных, но и между ядрами, связанными цепочкой связей. Это делает его полезным для идентификации более крупных взаимосвязанных сетей спиновых связей. Эта способность достигается за счет введения повторяющейся серии импульсов, которые вызывают изотропное смешивание в течение периода смешивания. Более длительное время изотропного смешивания приводит к распространению поляризации за счет увеличения числа связей. [9]
В случае олигосахаридов каждый остаток сахара представляет собой изолированную спиновую систему, поэтому можно дифференцировать все протоны определенного остатка сахара. Также доступна одномерная версия TOCSY, и путем облучения одного протона можно выявить остальную часть спиновой системы. Последние достижения в этой методике включают эксперимент TOCSY 1D-CSSF (селективный фильтр химического сдвига), который дает спектры более высокого качества и позволяет надежно извлекать константы связи и использовать их для определения стереохимии.
TOCSY иногда называют «гомоядерной спектроскопией Гартмана-Хана» (HOHAHA). [10]
НЕАДЕКВАТНЫЙ [11] — метод, часто используемый для обнаружения связей 13 C между соседними атомами углерода. Поскольку естественное содержание 13 C составляет всего около 1%, только около 0,01% изучаемых молекул будут иметь два близлежащих атома 13 C, необходимые для сигнала в этом эксперименте. Однако методы корреляционного выбора используются (аналогично DQF COSY) для предотвращения сигналов от одиночных атомов 13 C, чтобы можно было легко разрешить двойные сигналы 13 C. Каждая связанная пара ядер дает пару пиков на НЕАДЕКВАТНОМ спектре, оба из которых имеют одну и ту же вертикальную координату, которая представляет собой сумму химических сдвигов ядер; горизонтальная координата каждого пика представляет собой химический сдвиг для каждого из ядер в отдельности. [12]
Гетероядерная корреляционная спектроскопия дает сигнал, основанный на взаимодействии ядер двух разных типов. Часто два ядра представляют собой протоны и другое ядро (называемое «гетероядро»). По историческим причинам эксперименты, в которых в период обнаружения регистрируется спектр протона, а не гетероядра, называются «обратными» экспериментами. Это связано с тем, что низкое естественное содержание большинства гетероядер приведет к тому, что спектр протонов будет перегружен сигналами от молекул без активных гетероядер, что сделает его бесполезным для наблюдения желаемых связанных сигналов. С появлением методов подавления этих нежелательных сигналов эксперименты с обратной корреляцией, такие как HSQC, HMQC и HMBC, сегодня стали гораздо более распространенными. «Нормальная» гетероядерная корреляционная спектроскопия, при которой регистрируется гетероядерный спектр, известна как HETCOR. [13]
HSQC обнаруживает корреляции между ядрами двух разных типов, разделенных одной связью. Этот метод дает один пик на пару связанных ядер, две координаты которых представляют собой химические сдвиги двух связанных атомов. [15]
HSQC работает путем передачи намагниченности от ядра I (обычно протона) к ядру S (обычно гетероатому) с использованием последовательности импульсов INEPT ; этот первый шаг делается потому, что протон имеет большую равновесную намагниченность и, таким образом, этот шаг создает более сильный сигнал. Затем намагниченность развивается и затем передается обратно ядру I для наблюдения. Затем дополнительно можно использовать дополнительный этап спинового эха для разделения сигнала, упрощая спектр за счет объединения мультиплетов в один пик. Нежелательные несвязанные сигналы удаляются путем проведения эксперимента дважды с обратной фазой одного конкретного импульса; это меняет знаки желаемых, но не нежелательных пиков, поэтому вычитание двух спектров даст только желаемые пики. [15]
Гетероядерная многоквантовая корреляционная спектроскопия (HMQC) дает тот же спектр, что и HSQC, но с использованием другого метода. Оба метода дают одинаковые результаты по качеству для молекул малого и среднего размера, но считается, что HSQC лучше подходит для более крупных молекул. [15]
HMBC обнаруживает гетероядерные корреляции в более длинных диапазонах, около 2–4 связей. Трудность обнаружения корреляций множественных связей заключается в том, что последовательности HSQC и HMQC содержат определенное время задержки между импульсами, что позволяет обнаруживать только диапазон вокруг определенной константы связи. Это не проблема для методов с одной связью, поскольку константы связи имеют тенденцию лежать в узком диапазоне, но константы связи с несколькими связями охватывают гораздо более широкий диапазон и не могут быть полностью учтены в одном эксперименте HSQC или HMQC. [16]
В HMBC эта трудность преодолевается за счет исключения одной из этих задержек из последовательности HMQC. Это увеличивает диапазон констант связи, которые можно обнаружить, а также уменьшает потери сигнала из-за релаксации. Платой за это является то, что это исключает возможность разделения спектра и вносит в сигнал фазовые искажения. Существует модификация метода HMBC, которая подавляет сигналы с одной связью, оставляя только сигналы с несколькими связями. [16]
Эти методы устанавливают корреляции между ядрами, физически близкими друг к другу, независимо от того, существует ли между ними связь. Они используют ядерный эффект Оверхаузера (NOE), посредством которого близлежащие атомы (в пределах примерно 5 Å) подвергаются перекрестной релаксации по механизму, связанному со спин-решеточной релаксацией .
В NOESY для установления корреляций используется ядерная кросс-релаксация Оверхаузера между ядерными спинами во время периода смешивания. Полученный спектр аналогичен COSY, с диагональными пиками и перекрестными пиками, однако перекрестные пики соединяют резонансы от ядер, которые пространственно близки, а не от тех, которые связаны друг с другом сквозной связью. Спектры NOESY также содержат дополнительные аксиальные пики , которые не несут дополнительной информации и могут быть устранены с помощью другого эксперимента, изменив фазу первого импульса. [17]
Одним из применений NOESY является исследование крупных биомолекул, например, ЯМР белков , в котором взаимосвязи часто можно установить с помощью последовательного ходьбы .
Эксперимент NOESY также можно провести в одномерном режиме, предварительно выбрав отдельные резонансы. Спектры считываются, когда предварительно выбранные ядра дают сильный отрицательный сигнал, в то время как соседние ядра идентифицируются по более слабым положительным сигналам. Это только показывает, какие пики имеют измеримые NOE для интересующего резонанса, но занимает гораздо меньше времени, чем полный 2D-эксперимент. Кроме того, если заранее выбранное ядро меняет окружающую среду в течение времени эксперимента, можно наблюдать множественные негативные сигналы. Это обеспечивает обмен информацией, аналогичный методу ЯМР EXSY (обменная спектроскопия).
Эксперименты NOESY являются важным инструментом для идентификации стереохимии молекулы в растворителе, тогда как рентгеноструктурный анализ монокристаллов используется для идентификации стереохимии молекулы в твердой форме.
В HOESY, как и в NOESY, используется для перекрестной релаксации между ядерными спинами. Однако HOESY может предоставить информацию о других активных ядрах ЯМР в пространственно значимой форме. Примеры включают любые ядра X{Y} или X→Y, такие как 1 H → 13 C, 19 F → 13 C, 31 P → 13 C или 77 Se → 13 C. В экспериментах обычно наблюдаются NOE от протонов на X, X. { 1 H}, но не обязательно включает протоны. [18]
ROESY похож на NOESY, за исключением того, что исходное состояние отличается. Вместо наблюдения кросс-релаксации из начального состояния z -намагниченности, равновесная намагниченность поворачивается на ось x , а затем блокируется по спину внешним магнитным полем, так что она не может прецессировать. Этот метод полезен для определенных молекул, время корреляции вращения которых попадает в диапазон, где ядерный эффект Оверхаузера слишком слаб, чтобы его можно было обнаружить, обычно это молекулы с молекулярной массой около 1000 дальтон , поскольку ROESY имеет другую зависимость между временем корреляции и перекрестным -константа скорости релаксации. В NOESY константа скорости кросс-релаксации меняется от положительной к отрицательной по мере увеличения времени корреляции, образуя диапазон, в котором она близка к нулю, тогда как в ROESY константа скорости кросс-релаксации всегда положительна. [19] [20]
ROESY иногда называют «кросс-релаксацией, подходящей для минимолекул, эмулируемых заблокированными спинами» (CAMELSPIN). [20]
В отличие от коррелированных спектров, разрешенные спектры распределяют пики в эксперименте 1D-ЯМР в два измерения без добавления каких-либо дополнительных пиков. Эти методы обычно называют спектроскопией с J-разрешением, но иногда их также называют спектроскопией с разрешением по химическому сдвигу или спектроскопией с δ-разрешением. Они полезны для анализа молекул, для которых спектры 1D-ЯМР содержат перекрывающиеся мультиплеты, поскольку спектр с J-разрешением вертикально смещает мультиплет от каждого ядра на разную величину. Каждый пик в 2D-спектре будет иметь ту же горизонтальную координату, что и в несвязанном 1D-спектре, но его вертикальная координата будет химическим сдвигом одиночного пика, который имеет ядро в несвязанном 1D-спектре. [21]
Для гетероядерной версии простейшая используемая последовательность импульсов называется экспериментом Мюллера-Кумара-Эрнста (МКЭ), который имеет один импульс 90 ° для гетероядра в течение периода подготовки, без периода смешивания и применяет сигнал развязки к протону. в период обнаружения. Существует несколько вариантов этой последовательности импульсов, которые являются более чувствительными и точными и подпадают под категории методов вентильной развязки и методов спин-флип . Гомоядерная спектроскопия с J-разрешением использует последовательность импульсов спинового эха . [21]
Также можно проводить 3D- и 4D-эксперименты, иногда последовательно запуская последовательности импульсов из двух или трех 2D-экспериментов. Однако многие из обычно используемых 3D-экспериментов представляют собой эксперименты с тройным резонансом ; примеры включают эксперименты HNCA и HNCOCA , которые часто используются в ЯМР белков .