stringtranslate.com

TUNEL-анализ

Печень мыши с апоптотической клеткой, окрашенной TUNEL

Маркировка концов терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы dUTP ( TUNEL ) представляет собой метод обнаружения фрагментации ДНК путем маркировки 3′-гидроксильных концов в двухцепочечных разрывах ДНК, образующихся во время апоптоза . [1] [2]

Метод

TUNEL — это метод обнаружения апоптотической фрагментации ДНК , широко используемый для идентификации и количественной оценки апоптотических клеток или для обнаружения чрезмерного разрыва ДНК в отдельных клетках. [3] Анализ основан на использовании терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы (TdT), фермента , который катализирует присоединение дезоксинуклеотидов, помеченных флуорохромом или другим маркером , к 3'-гидроксильным концам двухцепочечных разрывов ДНК. Он также может маркировать клетки , имеющие повреждения ДНК другими способами, нежели в ходе апоптоза.

История

Анализ TUNEL на основе флуорохрома, применимый для проточной цитометрии , объединяющий обнаружение разрывов цепей ДНК относительно положения фазы клеточного цикла , был первоначально разработан Горчице и др. [4] Одновременно с этим анализ маркировки авидин-пероксидазой, применимый для микроскопа поглощения света , был описан Гавриели и др. [5] С 1992 года TUNEL стал одним из основных методов обнаружения апоптотической запрограммированной гибели клеток. [6] Однако в течение многих лет ведутся споры о его точности из-за проблем в первоначальном анализе, из-за которых некротические клетки неправильно маркировались как апоптотические. [7] Впоследствии метод был значительно улучшен, и при правильном выполнении он должен идентифицировать только клетки в последней фазе апоптоза . [8] [9] Новые методы включают dUTP, модифицированные флуорофорами или гаптенами, включая биотин или бром , которые могут быть обнаружены напрямую в случае флуоресцентно-модифицированного нуклеотида (т. е. флуоресцеин-dUTP), или косвенно со стрептавидином или антителами , если используются биотин-dUTP или BrdUTP, соответственно. Наиболее чувствительным из них является метод, использующий включение BrdUTP с помощью TdT с последующим иммуноцитохимическим обнаружением BrdU . [10]

Ссылки

  1. ^ Gorczyca W, Traganos F, Jesionowska H, ​​Darzynkiewicz Z (1993). «Наличие разрывов нитей ДНК и повышенная чувствительность ДНК in situ к денатурации в аномальных человеческих сперматозоидах. Аналогия с апоптозом соматических клеток». Exp Cell Res . 207 (1): 202–205. doi :10.1006/excr.1993.1182. PMID  8391465.
  2. ^ Lozano GM, Bejarano I, Espino J, González D, Ortiz A, García JF, Rodríguez AB, Pariente JA (2009). «Капацитация в градиенте плотности — наиболее подходящий метод для улучшения оплодотворения и снижения количества сперматозоидов с положительной фрагментацией ДНК у бесплодных мужчин». Anatolian Journal of Obstetrics & Gynecology . 3 (1): 1–7.
  3. ^ Lozano GM, Bejarano I, Espino J, González D, Ortiz A, García JF, Rodríguez AB, Pariente JA (2009). «Связь между активностью каспазы и маркерами апоптоза в сперме человека в ответ на перекись водорода и прогестерон». Журнал репродукции и развития . 55 (6): 615–621. doi : 10.1262/jrd.20250 . PMID  19734695.
  4. ^ Gorczyca W, Bruno S, Darzynkiewicz RJ, Gong J, Darzynkiewicz Z (1992). «Разрывы ДНК, происходящие во время апоптоза: их раннее обнаружение in situ с помощью терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы и анализов трансляции ника и профилактика ингибиторами сериновой протеазы». International Journal of Oncology . 1 (6): 639–648. doi :10.3892/ijo.1.6.639. PMID  21584593.
  5. ^ Gavrieli Y, Sherman Y, Ben-Sasson SA (1992). «Идентификация запрограммированной клеточной смерти in situ с помощью специфической маркировки фрагментации ядерной ДНК». J. Cell Biol . 119 (3): 493–501. doi :10.1083/jcb.119.3.493. PMC 2289665. PMID  1400587 . {{cite journal}}: CS1 maint: multiple names: authors list (link)
  6. ^ Darzynkiewicz Z, Galkowski D, Zhao H (2008). "Анализ апоптоза цитометрией с использованием анализа TUNEL". Методы . 44 (3): 250–254. doi :10.1016/j.ymeth.2007.11.008. PMC 2295206. PMID  18314056 . 
  7. ^ Grasl-Kraupp B, Ruttkay-Nedecky B, Koudelka H, ​​Bukowska K, Bursch W, Schulte-Hermann R (1995). «In situ обнаружение фрагментированной ДНК (анализ TUNEL) не позволяет различить апоптоз, некроз и аутолитическую гибель клеток: предостережение». Гепатология . 21 (5): 1465–8. doi : 10.1002/hep.1840210534 . PMID  7737654. S2CID  28119339.
  8. ^ Негоеску А., Лоримье П., Лабат-Мольер Ф., Друэ С., Роберт С., Гильерме С., Брамбилла С., Брамбилла Е. (1996). «Мечение апоптотических клеток in situ методом TUNEL: улучшение и оценка клеточных препаратов». J Histochem Cytochem . 44 (9): 959–68. дои : 10.1177/44.9.8773561 . ПМИД  8773561.
  9. ^ Negoescu A, Guillermet C, Lorimier P, Brambilla E, Labat-Moleur F (1998). «Значение фрагментации ДНК при апоптозе в отношении специфичности TUNEL». Biomed Pharmacother . 52 (6): 252–8. doi :10.1016/S0753-3322(98)80010-3. PMID  9755824.
  10. ^ Ли X, Дарзинкевич З. (1995). «Маркировка разрывов нитей ДНК с помощью BrdUTP. Обнаружение апоптоза и пролиферации клеток». Cell Proliferation . 28 (11): 571–579. doi :10.1111/j.1365-2184.1995.tb00045.x. PMID  8555370. S2CID  28993497.

Внешние ссылки