Полимеразная цепная реакция тачдауна

Тип ПЦР

Полимеразная цепная реакция тачдауна или полимеразная цепная реакция тачдауна — это метод полимеразной цепной реакции, при котором праймеры избегают амплификации неспецифических последовательностей. ^[1] Температура отжига во время полимеразной цепной реакции определяет специфичность отжига праймера. Температура плавления праймера устанавливает верхний предел температуры отжига. При температурах чуть выше этой точки будет происходить только очень специфическое спаривание оснований между праймером и шаблоном. При более низких температурах праймеры связываются менее специфично. Неспецифическое связывание праймера скрывает результаты полимеразной цепной реакции, поскольку неспецифические последовательности, с которыми праймеры отжигаются на ранних этапах амплификации, «затопят» любые специфические последовательности из-за экспоненциальной природы полимеразной амплификации . ^[2]

Метод

Схема ПЦР тачдауна. Первый отжиг между праймером и ДНК происходит при начальной температуре, второй — после понижения температуры на . Поэтому продукт второго отжига оказывается в невыгодном положении на . ${\displaystyle \Delta T}$ ${\displaystyle 2^{-1}}$

Самые ранние этапы цикла полимеразной цепной реакции тачдауна имеют высокие температуры отжига. Температура отжига постепенно уменьшается для каждого последующего набора циклов. Праймер будет отжигаться при самой высокой температуре, которая наименее допускает неспецифическое связывание, которое он может выдержать. Таким образом, первая амплифицированная последовательность — это та, что находится между областями наибольшей специфичности праймера; наиболее вероятно, что это и есть интересующая последовательность. Эти фрагменты будут далее амплифицироваться в ходе последующих раундов при более низких температурах и вытеснят неспецифические последовательности, с которыми праймеры могут связываться при этих более низких температурах. Если праймер изначально (во время фаз с более высокой температурой) связывается с интересующей последовательностью, последующие раунды полимеразной цепной реакции могут быть выполнены с продуктом для дальнейшей амплификации этих фрагментов. Тачдаун увеличивает специфичность реакции при более высоких температурах и увеличивает эффективность к концу за счет снижения температуры отжига. ^[3]

С математической точки зрения продукты отжига при меньших температурах оказываются в невыгодном положении для первого отжига в цикле и второго в цикле для . ${\displaystyle 2^{i-j}}$ ${\displaystyle i}$ ${\displaystyle j}$ ${\displaystyle i,j\in \mathbb {N} ,i\geq j}$

Ссылки

1. Дон Р., Кокс П., Уэйнрайт Б., Бейкер К., Мэттик Дж. (1991). «ПЦР 'Touchdown' для обхода ложного праймирования во время амплификации гена». Nucleic Acids Res . 19 (14): 4008. doi :10.1093/nar/19.14.4008. PMC  328507. PMID  1861999 .
2. Хеккер К, Ру К (1996). «Высокие и низкие температуры отжига увеличивают как специфичность, так и выход в touchdown и stepdown PCR». BioTechniques . 20 (3): 478–85. doi : 10.2144/19962003478 . PMID  8679209.
3. Roux K (1994). «Использование несовпадающих пар праймер-матрица в ПЦР с тачдауном». BioTechniques . 16 (5): 812–4. PMID  8068332.