Агроинфильтрация — это метод, используемый в биологии растений и особенно в последнее время в биотехнологии растений для индукции временной экспрессии генов в растении , или изолированных листьях растения, или даже в культурах растительных клеток, чтобы получить желаемый белок . В этом методе суспензия Agrobacterium tumefaciens вводится в лист растения путем прямой инъекции или вакуумной инфильтрации, или приводится в связь с растительными клетками, иммобилизованными на пористой подложке (клеточные пакеты растений), [1] после чего бактерии переносят желаемый ген в растительные клетки посредством переноса Т-ДНК . Основным преимуществом агроинфильтрации по сравнению с более традиционной трансформацией растений является скорость и удобство, хотя выход рекомбинантного белка, как правило, также выше и более постоянен.
Первый шаг — введение интересующего гена в штамм Agrobacterium tumefaciens . Затем штамм выращивают в жидкой культуре , а полученные бактерии промывают и суспендируют в подходящем буферном растворе . Для инъекции этот раствор затем помещают в шприц (без иглы). Кончик шприца прижимают к нижней стороне листа , одновременно оказывая легкое противодавление на другую сторону листа. Затем суспензию Agrobacterium вводят в воздушные пространства внутри листа через устьица или иногда через крошечный надрез, сделанный на нижней стороне листа.
Вакуумная инфильтрация — еще один способ глубокого введения Agrobacterium в растительную ткань. В этой процедуре листовые диски, листья или целые растения погружаются в стакан с раствором, а стакан помещается в вакуумную камеру. Затем применяется вакуум, вытесняя воздух из межклеточного пространства листьев через устьица. Когда вакуум сбрасывается, разница давлений вытесняет суспензию «Agrobacterium» в листья через устьица в ткань мезофилла . Это может привести к тому, что почти все клетки любого листа будут контактировать с бактериями.
Попав внутрь листа, Agrobacterium остается в межклеточном пространстве и переносит интересующий ген как часть полученной из плазмиды Ti T-ДНК в большом количестве копий в растительные клетки. Перенос гена происходит, когда индуцируются растительные сигналы и между растительными клетками и бактериями устанавливается физический контакт. Бактерии создают механизм, который прорывает отверстие и переносит новую цепь T-ДНК в растительную клетку. T-ДНК перемещается в ядро растения и начинает интегрироваться в хромосому растения. Затем ген временно экспрессируется посредством синтеза РНК из соответствующих промоторных последовательностей во всех трансфицированных клетках (отбор для стабильной интеграции не проводится). Растение можно контролировать на предмет возможного эффекта в фенотипе , подвергать экспериментальным условиям или собирать и использовать для очистки интересующего белка . С помощью этого метода можно обрабатывать многие виды растений, но наиболее распространенными являются Nicotiana benthamiana и реже Nicotiana tabacum .
Транзиентная экспрессия в клеточных пакетах культивируемых растений — это новая процедура, недавно запатентованная Институтом Фраунгофера IVV, Германия. [2] Для этой техники суспензионные культивируемые клетки табака (например, клеточные линии NT1 или BY2 Nicotiana tabacum ) иммобилизуются путем фильтрации на пористую подложку для формирования хорошо аэрируемого клеточного пакета, затем инкубируются с рекомбинантными Agrobacterium в течение времени, необходимого для переноса T-ДНК, перед повторной фильтрацией для удаления избытка бактерий и жидкости. Инкубация клеточного пакета во влажной среде в течение нескольких дней обеспечивает транзиентную экспрессию белка. Секретируемые белки можно вымыть из клеточного пакета путем применения буфера и дальнейшей фильтрации.
Довольно часто происходит ко-фильтрация Agrobacterium , несущей интересующую конструкцию, вместе с другой Agrobacterium, несущей ген белка-супрессора подавления, например, кодирующего белок p19 из фитопатогенного вируса кустистой карликовости томатов (TBSV) или белок NSs [3] из вируса пятнистого увядания томатов (TSWV). TBSV был впервые обнаружен в 1935 году в томатах и приводит к задержке роста растений и деформированным плодам. TSWV был обнаружен в томатах в Австралии в 1915 году и в течение многих лет был единственным членом того, что сейчас известно как род Tospovirus , семейство Bunyaviridae .
Чтобы защитить себя от вирусов и других патогенов, которые вводят чужеродные нуклеиновые кислоты в их клетки, растения выработали систему посттранскрипционного подавления генов (PTGS), при которой из двухцепочечной РНК производятся малые интерферирующие РНК для создания специфичного для последовательности пути деградации, который эффективно подавляет неродные гены. [4] [5] Многие вирусы растений выработали механизмы, которые противостоят системам PTGS растений, развивая белки, такие как p19 и NS, которые мешают пути PTGS на разных уровнях. [6] [7] [8]
Хотя неясно, как именно p19 подавляет РНК-сайленсинг, исследования показали, что временно экспрессируемые белки в листьях Nicotiana benthamiana имеют до 50 раз более высокий выход при совместной фильтрации с TBSV p19. [9] [10]
TSWV и другие белки NSs тосповирусов показали свою эффективность в качестве супрессоров как локального, так и системного подавления [11] и могут быть полезной альтернативой p19, где последний, как было показано, неэффективен. В других исследованиях было показано, что p19 из вируса пятнистой морщинистости артишока имеет схожий, хотя и более слабый, эффект с p19 TBSV. [12]