_.png/1280px-Figure1_Definition_of_antisense_RNAs_(asRNAs)_.png)
Антисмысловая РНК ( асРНК ), также называемая антисмысловым транскриптом, [1] естественным антисмысловым транскриптом (NAT) [2] [3] [4] или антисмысловым олигонуклеотидом , [5] представляет собой одноцепочечную РНК , которая комплементарна кодирующей белок информационной РНК (мРНК), с которой она гибридизуется и тем самым блокирует ее трансляцию в белок . АсРНК (которые встречаются в природе) были обнаружены как у прокариот , так и у эукариот , [1] и могут быть классифицированы на короткие (<200 нуклеотидов) и длинные (>200 нуклеотидов) некодирующие РНК (нкРНК). [4] Основная функция асРНК — регулирование экспрессии генов . асРНК также могут быть получены синтетически и нашли широкое применение в качестве исследовательских инструментов для подавления генов . Они также могут иметь терапевтическое применение. [6] [1] [4]
Некоторые из самых ранних asRNAs были обнаружены при исследовании функциональных белков. Примером была asRNA micF . При характеристике внешнего мембранного порина ompC в E.coli некоторые из наблюдаемых клонов промотора ompC были способны подавлять экспрессию другого мембранного порина, такого как ompF. Было обнаружено, что область, ответственная за эту функцию подавления, представляет собой локус из 300 пар оснований выше промотора ompC. Эта область из 300 пар оснований на 70% гомологична последовательности с 5'-концом мРНК ompF, и, таким образом, транскрипт этого локуса из 300 пар оснований был комплементарен мРНК ompF. Позднее было обнаружено, что этот транскрипт, обозначенный как micF, является asRNA ompF и способен подавлять экспрессию ompF в условиях стресса, образуя дуплекс с мРНК ompF. Это вызывает деградацию мРНК ompF. [2]
В отличие от micF РНК, обнаруженной случайно, большинство asRNA были обнаружены в ходе поиска малых регуляторных РНК по всему геному и анализа транскриптома . Традиционно первый шаг включает вычислительные предсказания на основе некоторых известных характеристик asRNA. Во время вычислительного поиска исключаются кодирующие регионы. Регионы, которые, как прогнозируется, имеют консервативные структуры РНК и действуют как сироты-промоторы и Rho-независимые терминаторы, являются предпочтительными во время анализа. Поскольку вычислительный поиск фокусируется на межгенной области , asRNA, которые транскрибируются с противоположной цепи кодирующего гена, скорее всего, будут пропущены при использовании этого метода. Для обнаружения asRNA, транскрибируемой с кодирующей области, можно использовать олигонуклеотидные микрочипы . В этом методе в качестве зондов можно использовать одну или обе цепи кодирующих генов. Помимо вычислительного поиска и микрочипов, некоторые asRNA были обнаружены путем секвенирования клонов кДНК, а также картирования промоторных элементов. [7] Хотя многие открытия из подходов, упомянутых выше, привели к появлению множества возможных asRNA, только немногие из них были доказаны как фактические asRNA с помощью дальнейших функциональных тестов. Чтобы свести к минимуму количество ложноположительных результатов, новые подходы последних лет были сосредоточены на транскрипции, специфичной для нитей, связывании хроматина некодирующих РНК и исследованиях отдельных клеток. [1]
Идея использования asRNA в качестве лекарственных мишеней возникла в 1978 году, когда Замечник и Стивенсон обнаружили антисмысловой олигонуклеотид к вирусной РНК вируса скаркомы Рауса, который был способен ингибировать репликацию вируса и синтез белка. С тех пор много усилий было направлено на разработку asRNA в качестве лекарственных кандидатов. В 1998 году первый препарат asRNA, фомивирсен , был одобрен FDA. Фомивирсен, олигонуклеотид из 21 пары оснований, был разработан для лечения цитомегаловирусного ретинита у пациентов со СПИДом. Он работает, воздействуя на транскрибированную мРНК вируса и, следовательно, ингибируя репликацию цитомегаловируса. Несмотря на то, что фомивирсен был прекращен в 2004 году из-за потери рынка, он послужил успешным и вдохновляющим примером использования asRNA в качестве лекарственных мишеней или лекарственных кандидатов. [5]
Другим примером использования asRNA в качестве терапевтического агента является мипомерсен , который был одобрен FDA в 2013 году. Мипомерсен был разработан для управления уровнем холестерина липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) у пациентов с гомозиготной семейной гиперхолестеринемией (HoFH), которая является редким аутосомно-доминантным генетическим заболеванием. Из-за высокого уровня общего холестерина (650–1000 мг/дл) и рецептора ЛПНП (выше 600 мг/дл) при HoFH, у пациентов с HoFH высокий риск ишемической болезни сердца. Поскольку было обнаружено, что белок apo-B-100 необходим для производства липопротеинов очень низкой плотности (VLDL) и ЛПНП, мипомерсен дополняет мРНК apo-B-100 и нацеливает ее на зависимую от РНКазы H деградацию. В конечном итоге мипомерсен способен снижать уровень ЛПНП. [8]
Первые обнаруженные asRNA были в прокариотах, включая плазмиды , бактериофаги и бактерии . Например, в плазмиде ColE1 asRNA, называемая RNA I, играет важную роль в определении числа копий плазмиды, контролируя репликацию. Репликация ColE1 зависит от транскрипции праймерной RNA, называемой RNA II. После транскрипции RNA II она гибридизуется со своей ДНК-матрицей и позже расщепляется РНКазой H. В присутствии asRNA RNA I, RNA I и RNA II образуют дуплекс, который вносит конформационные изменения в RNA II. Следовательно, RNA II не может гибридизоваться со своей ДНК-матрицей, что приводит к низкому числу копий ColE1. В бактериофаге P22 asRNA sar помогает регулировать между литическим и лизогенным циклом, контролируя экспрессию Ant. [9] Помимо экспрессии в прокариотах, asRNA были также обнаружены в растениях. Наиболее хорошо описанный пример регуляции asRNA в растениях — ген Flowering Locus C (FLC) . Ген FLC в Arabidopsis thaliana кодирует фактор транскрипции, который предотвращает экспрессию ряда генов, которые вызывают переход цветения. В холодной среде asRNA гена FLC, обозначенная COOLAIR, экспрессируется и подавляет экспрессию FLC посредством модификации хроматина, что, следовательно, обеспечивает цветение. [10] Другим хорошо изученным примером является ген DOG1 (Delay of Germination 1). Уровень его экспрессии отрицательно регулируется антисмысловым транскриптом (asDOG1 или 1GOD), действующим в цис-положении. [11] В клетках млекопитающих типичным примером регуляции asRNA является инактивация Х-хромосомы. Xist , asRNA, может привлекать поликомбный репрессивный комплекс 2 (PRC2), что приводит к гетерохроматинизации Х-хромосомы. [3]
Антисмысловые РНК можно классифицировать разными способами. С точки зрения регуляторных механизмов некоторые авторы группируют asRNAs в РНК-ДНК взаимодействия, РНК-РНК взаимодействия либо в ядре , либо в цитоплазме и РНК-белковые взаимодействия ( эпигенетические ). [3] Антисмысловые РНК можно классифицировать по типу промоторов, которые инициируют экспрессию asRNAs: независимые промоторы, общие двунаправленные промоторы или криптические промоторы. С точки зрения длины, хотя asRNAs в целом классифицируются как lncRNAs , существуют короткие asRNAs длиной менее 200 пар оснований. Поскольку регуляторный механизм asRNAs, как было обнаружено, является видоспецифичным, asRNAs также можно классифицировать по видам. [1] Один из распространенных способов классификации asRNAs — по тому, где asRNAs транскрибируются относительно своих целевых генов: цис-действующие и транс-действующие . [ требуется цитата ]
Цис-действующие asRNAs транскрибируются с противоположной цепи целевого гена в локусе целевого гена. Они часто демонстрируют высокую степень или полную комплементарность с целевым геном. Если цис-действующая asRNA регулирует экспрессию гена, нацеливаясь на мРНК, она может нацеливаться только на индивидуальную мРНК. При взаимодействии с целевыми мРНК цис-действующие asRNAs могут либо блокировать связывание рибосомы, либо привлекать РНКазу для деградации целевых мРНК. Следовательно, функция этих цис-действующих asRNAs заключается в подавлении трансляции целевых мРНК. [2] Помимо цис-действующих asRNAs, которые нацеливаются на мРНК, существуют цис-действующие эпигенетические сайленсеры и активаторы . Было показано, что антисмысловая РНК подавляет трансляцию домена LINE1-ORF2 Entamoeba histolytica . Однако пока не подтверждено, является ли она цис-действующей или транс-. [12]
С точки зрения эпигенетической модификации, цис-действие относится к природе этих asRNA, которые регулируют эпигенетические изменения вокруг локусов , где они транскрибируются. Вместо того, чтобы нацеливаться на отдельные мРНК, эти цис-действующие эпигенетические регуляторы могут привлекать ферменты, модифицирующие хроматин, которые могут оказывать влияние как на локусы транскрипции, так и на соседние гены. [3]
Транс-действующие asRNAs транскрибируются из локусов, которые удалены от целевых генов. В отличие от цис-действующих asRNAs, они демонстрируют низкую степень комплементарности с целевым геном, но могут быть длиннее, чем цис-действующие asRNAs. Они также могут быть нацелены на несколько локусов. Из-за этих свойств транс-действующих asRNAs они образуют менее стабильные комплексы со своими целевыми транскриптами и иногда требуют помощи от белка-шаперона РНК , такого как Hfq, для выполнения своих функций. Из-за сложности транс-действующих asRNAs они в настоящее время считаются менее поддающимися лечению мишенями. [2]
Многие примеры asRNA демонстрируют ингибирующее действие на инициацию транскрипции посредством эпигенетических модификаций.
Метилирование ДНК может привести к долгосрочному подавлению определенных генов. Подавление функциональных белков посредством метилирования ДНК, индуцированного asRNA, было обнаружено при нескольких заболеваниях человека. В классе альфа-талассемии , типе заболевания крови, при котором снижается уровень гемоглобина, что приводит к недостатку кислорода в тканях, [13] ген гемоглобина альфа1 (HBA1) подавляется аномальным транскриптом предполагаемого РНК-связывающего белка Luc7-like (LUC71), который служит asRNA для HBA1 и вызывает метилирование промотора HBA1. [1] Другим примером является подавление гена-супрессора опухолей p15INK4b, также называемого CDKN2B, при остром лимфобластном лейкозе и остром миелоидном лейкозе. АсРНК, которая отвечает за этот эффект подавления, представляет собой антисмысловую некодирующую РНК в локусе INK ( ANRIL ), которая экспрессируется в том же локусе, который кодирует p15INK4b. [3]
В эукариотических клетках ДНК плотно упакована гистонами . Модификация гистонов может изменить взаимодействие с ДНК, что может дополнительно вызвать изменения в экспрессии генов . Биологические последствия метилирования гистонов зависят от контекста. В целом, метилирование гистонов приводит к репрессии генов, но активация генов также может быть достигнута. [14] Имеются данные, свидетельствующие о том, что метилирование гистонов может быть вызвано asRNA. Например, ANRIL, в дополнение к способности вызывать метилирование ДНК, может также репрессировать соседний ген CDKN2B , CDKN2A , путем привлечения поликомбного репрессивного комплекса 2 (PRC2), что приводит к метилированию гистонов (H3K27me). Другим классическим примером является инактивация Х-хромосомы XIST . [1]
Эпигенетическая модификация, вызванная ANRIL, является примером цис-действующей эпигенетической регуляции. [3] Кроме того, модификация хроматина, вызванная антисмысловой РНК, может быть как транс-действующей. Например, у млекопитающих asRNA HOTAIR транскрибируется из локуса гомеобокса C (HOXC), но она рекрутирует PRC2 в HOXD, который откладывает H3K27 и подавляет HOXD. HOTAIR высоко экспрессируется в первичных опухолях молочной железы. [1]
Эпигенетические регуляции, такие как метилирование ДНК и метилирование гистонов, могут подавлять экспрессию генов, подавляя инициацию транскрипции. Иногда, однако, подавление генов может быть достигнуто путем преждевременного прекращения или замедления процесса транскрипции. АсРНК могут быть вовлечены в этот уровень регуляции генов. Например, в бактериальных или эукариотических клетках, где присутствуют сложные РНК-полимеразы, двунаправленная транскрипция в одном и том же локусе может привести к столкновению полимераз и, как следствие, к прекращению транскрипции. Даже когда столкновение полимераз маловероятно во время слабой транскрипции, также может произойти пауза полимеразы, которая блокирует удлинение и приводит к репрессии генов. Одним из примеров является репрессия гена IME4 его асРНК RME2. Другим способом воздействия на транскрипцию ко-транскрипционно является блокирование сплайсинга. Одним из классических примеров у человека является ген цинкового пальца E-box binding homeobox 2 ( ZEB2 ), который кодирует E-кадгерин, транскрипционный репрессор. Эффективная трансляция мРНК ZEB2 требует наличия внутреннего сайта входа рибосомы (IRES) в интроне мРНК на 5'-конце . При экспрессии asRNA ZEB2 он может маскировать сайт сплайсинга и поддерживать IRES в мРНК, что приводит к эффективному синтезу E-кадгерина. Наконец, в зависимости от уровня экспрессии asRNA могут быть получены различные изоформы смыслового транскрипта. Таким образом, регуляция, зависящая от asRNA, не ограничивается механизмом включения/выключения; скорее, она представляет собой тонкую систему управления тоном. [1]
Прямая посттранскрипционная модуляция asRNAs относится к мРНК, которые являются мишенью для asRNAs напрямую; таким образом, трансляция затрагивается. Некоторые характеристики этого типа asRNAs описаны в цис- и транс-действующих asRNAs. Этот механизм относительно быстрый, поскольку и целевая мРНК, и ее asRNA должны присутствовать одновременно в одной и той же клетке. Как описано в цис-действующих asRNAs, спаривание мРНК-asRNA может привести к блокировке входа рибосомы и деградации, зависимой от РНКазы H. В целом, asRNAs, целевые для мРНК, могут либо активировать, либо ингибировать трансляцию смысловых мРНК, причем ингибирующий эффект является наиболее распространенным. [1]
Как регуляторный элемент, asRNAs имеют много преимуществ, чтобы рассматриваться в качестве цели для лекарств. Во-первых, asRNAs регулируют экспрессию генов на нескольких уровнях, включая транскрипцию, посттранскрипцию и эпигенетическую модификацию. Во-вторых, цис-действующие asRNAs являются последовательными специфическими и демонстрируют высокую степень комплементарности с целевыми генами. [1] В-третьих, уровень экспрессии asRNAs очень мал по сравнению с уровнем целевых мРНК; поэтому для получения эффекта требуется лишь небольшое количество asRNAs. С точки зрения целей для лекарств это представляет собой огромное преимущество, поскольку для эффективности требуется лишь низкая дозировка. [4]
В последние годы идея нацеливания asRNAs для увеличения экспрессии генов специфичным для локуса образом привлекала большое внимание. Из-за природы разработки лекарств всегда проще иметь лекарства, функционирующие как понижающие регуляторы или ингибиторы. Однако существует необходимость в разработке лекарств, которые могут активировать или повышать экспрессию генов, таких как гены-супрессоры опухолей, нейропротекторные факторы роста и гены, которые обнаруживаются подавленными при определенных менделевских расстройствах. В настоящее время подход к восстановлению дефицитной экспрессии генов или функции белков включает заместительную терапию ферментами, терапию микроРНК и доставку функциональной кДНК. Однако каждый из них имеет некоторые недостатки. Например, синтезированный белок, используемый в заместительной терапии ферментами, часто не может имитировать всю функцию эндогенного белка. Кроме того, заместительная терапия ферментами является пожизненным обязательством и несет большую финансовую нагрузку для пациента. Из-за локус-специфической природы asRNA и свидетельств изменений в экспрессии asRNA при многих заболеваниях были предприняты попытки разработать одноцепочечные олигонуклеотиды, называемые антагоНАТ, для ингибирования asRNA и в конечном итоге для увеличения экспрессии определенных генов. [4]
Несмотря на обещания asRNAs в качестве лекарственных мишеней или кандидатов на лекарственные препараты, все еще есть некоторые проблемы, которые необходимо решить. [15] Прежде всего, asRNAs и antagoNATs могут легко разрушаться РНКазой или другими расщепляющими ферментами. Для предотвращения разрушения терапевтических олигонуклеотидов обычно требуется химическая модификация. Наиболее распространенной химической модификацией олигонуклеотидов является добавление фосфоротиоатной связи к остовам. [5] Однако фосфоротиоатная модификация может быть провоспалительной. После местной инъекции олигонуклеотидов, модифицированных фосфоротиоатом, наблюдались побочные эффекты, включая лихорадку, озноб или тошноту. Во-вторых, нецелевая токсичность также представляет собой большую проблему. Несмотря на локус-специфическую природу эндогенных asRNAs, только 10–50% синтезированных олигонуклеотидов показали ожидаемый эффект нацеливания. Одной из возможных причин этой проблемы является высокое требование к структуре asRNAs для распознавания целевой последовательностью и РНКазой H. Одно несоответствие может привести к искажению вторичной структуры и вызвать нецелевые эффекты. [4] Наконец, было показано, что искусственные asRNAs имеют ограниченный внутриклеточный захват. [5] Хотя было показано, что нейроны и глия обладают способностью свободно поглощать голые антисмысловые олигонуклеотиды, отслеживаемые носители, такие как вирусы и липидные везикулы, по-прежнему были бы идеальными для контроля и мониторинга внутриклеточной концентрации и метаболизма. [4]