stringtranslate.com

Апоптотическая фрагментация ДНК

Белые полосы ДНК на темно-сером фоне, напоминающие ступеньки лестницы.
Апоптотическая фрагментация ДНК, визуализированная с помощью анализа ДНК-леддеринга (слева). Маркер 1 кб (в середине) и контрольная ДНК (справа) включены для сравнения.

Апоптотическая фрагментация ДНК является ключевой особенностью апоптоза , типа запрограммированной клеточной смерти . Апоптоз характеризуется активацией эндогенных эндонуклеаз , в частности, ДНКазы, активируемой каспазой-3 (CAD), [1] с последующим расщеплением ядерной ДНК на межнуклеосомные фрагменты примерно из 180 пар оснований  (п. н.) и их кратных (360, 540 и т. д.). Апоптотическая фрагментация ДНК используется в качестве маркера апоптоза и для идентификации апоптотических клеток либо с помощью анализа ДНК-лестницы , [2] анализа TUNEL , [3] [4] или путем обнаружения клеток с дробным содержанием ДНК («клетки суб G 1 ») на гистограммах частоты содержания ДНК, например, как в анализе Николетти . [5] [6]

Механизм

Фермент, ответственный за апоптотическую фрагментацию ДНК, — это C-аспаза-активируемая D-наза (CAD). CAD обычно ингибируется другим белком, ингибитором C-аспаза-активируемой D - назы ( ICAD ) . Во время апоптоза апоптотическая эффекторная каспаза , каспаза -3 , расщепляет ICAD и, таким образом, активирует CAD. [7]

Двойная цепь ДНК, обернутая вокруг ядра гистоновых белков
Нуклеосома , состоящая из ДНК (серая), обернутой вокруг тетрамера гистонов (цветной). При апоптотической фрагментации ДНК ДНК расщепляется в межнуклеосомной линкерной области, которая является частью ДНК, не обернутой вокруг гистонов.

CAD расщепляет ДНК в межнуклеосомных линкерных участках между нуклеосомами , содержащими белок структурами, которые встречаются в хроматине с интервалом ~180 п.н. Это происходит потому, что ДНК обычно плотно обернута вокруг гистонов , основных белков нуклеосом. Линкерные участки являются единственными частями цепи ДНК, которые открыты и, таким образом, доступны для CAD.

Деградация ядерной ДНК в нуклеосомные единицы является одним из признаков апоптотической гибели клеток. Она происходит в ответ на различные апоптотические стимулы в самых разных типах клеток. Молекулярная характеристика этого процесса выявила специфическую ДНКазу (CAD, caspase-activated DNase), которая расщепляет хромосомную ДНК зависимым от каспазы образом. CAD синтезируется с помощью ICAD (ингибитора CAD), который действует как специфический шаперон для CAD и обнаруживается в комплексе с ICAD в пролиферирующих клетках. Когда клетки индуцируются для прохождения апоптоза, каспаза 3 расщепляет ICAD, чтобы диссоциировать комплекс CAD:ICAD, позволяя CAD расщеплять хромосомную ДНК. Таким образом, клетки, в которых отсутствует ICAD или которые экспрессируют мутантный ICAD, устойчивый к каспазе, не демонстрируют фрагментации ДНК во время апоптоза, хотя они демонстрируют некоторые другие признаки апоптоза и погибают.

Несмотря на то, что было проделано много работы по анализу апоптотических событий, мало информации доступно для связи времени морфологических особенностей на поверхности клетки и в ядре с биохимической деградацией ДНК в тех же клетках. Апоптоз может быть инициирован множеством различных механизмов в разных типах клеток, и кинетика этих событий сильно различается, от нескольких минут до нескольких дней в зависимости от клеточной системы. Наличие или отсутствие определенного апоптотического события(й), включая фрагментацию ДНК, зависит от «временного окна», в котором исследуется кинетический процесс апоптоза. Часто это может усложнить идентификацию апоптотических клеток, если популяции клеток анализируются только в одной временной точке, например, после индукции апоптоза.

Историческая справка

Открытие межнуклеосомной фрагментации геномной ДНК до регулярно повторяющихся олигонуклеосомных фрагментов, генерируемых Ca/Mg-зависимой эндонуклеазой, признано одним из наиболее хорошо охарактеризованных биохимических маркеров апоптоза ( программируемой гибели клеток).

В 1970 году Уильямсон описал, что цитоплазматическая ДНК, выделенная из клеток печени мыши после культивирования, характеризовалась фрагментами ДНК с молекулярной массой, состоящей из кратных 135 кДа . Это открытие согласуется с гипотезой о том, что эти фрагменты ДНК являются специфическим продуктом деградации ядерной ДНК. [8] В 1972 году Керр , Уайли и Карри ввели термин апоптоз и отличили этот тип гибели клеток от некроза на основе морфологических признаков. [9] В 1973 году Хьюиш и Бергойн во время изучения структуры субхроматина обнаружили, что хроматин доступен для эндонуклеазы Ca ++ /Mg ++ , что приводит к образованию продукта переваривания с регулярной серией молекулярной массы, аналогичной той, что ранее была описана Уильямсоном (1970). [10] В 1974 году Уильямс , Литтл и Шипли , используя клетки, подвергшиеся самым разным типам травм, обнаружили, что во время гибели клеток деградированная ДНК в «каждом случае имела модальное значение от 10(x6) до 10(x7) Дальтон, и для деградации ДНК требуется клеточный метаболизм». Однако это наблюдение не содержало указаний на то, «была ли атака надреза на молекулу ДНК случайной или, скорее, на определенном участке, имеющем структурное или функциональное значение». [11] В 1976 году Скалка , Матьясова и Чейкова описали межнуклеосомную фрагментацию облученной ДНК лимфоидного хроматина in vivo . [12]

Прошло шесть лет с 1972 по 1978/1980 гг., пока не была открыта и оценена межнуклеосомная фрагментация ДНК во время апоптотической гибели клеток как отличительный признак апоптоза. С 1972 г. ( Керр , Уайли и Карри [9] ) принято считать, что гибель лимфоцитов, вызванная глюкокортикоидами, является формой апоптоза. В 1978 г. Захарян и Погосян представили статью, в которой было показано, что деградация ДНК, вызванная глюкокортикоидами, в лимфоидной ткани, тимусе и селезенке крысы происходила по специфической схеме, образуя фрагменты ДНК, которые были электрофоретически похожи на те, которые наблюдались после обработки хроматина микрококковой нуклеазой, что указывало на межнуклеосомную схему расщепления деградации ДНК, происходящую во время апоптоза. [13] [14] Таким образом, была обнаружена первая связь между запрограммированной гибелью клеток/апоптозом и межнуклеосомной фрагментацией хроматиновой ДНК, которая вскоре стала специфической чертой апоптоза.

В 1980 году Уайли сообщил о дополнительных доказательствах в пользу паттерна межнуклеосомного расщепления ДНК как специфической особенности тимоцитов, обработанных глюкокортикоидами, подвергающихся апоптозу. [2] Паттерн межнуклеосомного расщепления ДНК наблюдался как специфическая особенность апоптоза в 1978/1980 годах и с тех пор стал признанным признаком запрограммированной гибели клеток. В 1992 году Горчица и др. [3] и Гавриели и др. [4] независимо друг от друга описали анализ фрагментации ДНК , основанный на использовании терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы ( TUNEL ), который стал одним из стандартных методов обнаружения и идентификации апоптотических клеток.

Анализы обнаружения

Проточная цитометрия чаще всего используется для обнаружения апоптотической фрагментации ДНК. [15] Анализ содержания ДНК методом проточной цитометрии может идентифицировать апоптотические клетки с фрагментированной ДНК как клетки с фракционным содержанием ДНК, часто называемые суб-G 1 клетками. Проточно-цитометрический анализ с использованием флуорохрома акридинового оранжевого показывает, что фрагментация ДНК внутри отдельных клеток является прерывистой, вероятно, отражая различные уровни ограничения доступности ДНК для ДНКазы супрануклеосомным и нуклеосомным уровнями структуры хроматина. [16] Наличие апоптотических «суб-G 1 клеток» также может быть обнаружено в клетках, предварительно фиксированных в этаноле , но не после фиксации в сшивающих фиксаторах, таких как формальдегид . Поздние S и G 2 апоптотические клетки не могут быть обнаружены с помощью этого подхода, поскольку их фракционное содержание ДНК может перекрываться таковым неапоптотических G 1 клеток. [17] Обработка клеток детергентом, до или одновременно с ДНК-флюорохромом, также выявляет фрагментацию ДНК из-за присутствия клеток суб-G1 или фрагментов клеток, как определено Николетти и др. [5]

Апоптотическую фрагментацию ДНК также можно обнаружить с помощью анализа TUNEL . Анализ TUNEL на основе флуорохрома, применимый для проточной цитометрии , коррелирует обнаружение разрывов цепей ДНК с клеточным содержанием ДНК и, таким образом, с положением фазы клеточного цикла . Анализ TUNEL с маркировкой авидин-пероксидазой применим для микроскопии поглощения света. Многие наборы, связанные с TUNEL, коммерчески доступны. Апоптотическую фрагментацию ДНК также анализируют с помощью электрофореза в агарозном геле для демонстрации «лестничного» рисунка с интервалами ~180 пар оснований . [1] Некроз , с другой стороны, обычно характеризуется случайной фрагментацией ДНК, которая образует «мазок» на агарозных гелях.

Смотрите также

Ссылки

  1. ^ Сакахира, Х; Энари, М; Нагата, С. (январь 1998 г.). «Расщепление ингибитора CAD при активации CAD и деградации ДНК во время апоптоза». Природа . 391 (6662): 96–9. Бибкод : 1998Natur.391...96S. дои : 10.1038/34214. PMID  9422513. S2CID  4329685.
  2. ^ ab Wyllie AH (1980-04-10). «Апоптоз тимоцитов, вызванный глюкокортикоидами, связан с активацией эндогенной эндонуклеазы». Nature . 284 (5756): 555–556. Bibcode :1980Natur.284..555W. doi :10.1038/284555a0. ISSN  0028-0836. PMID  6245367. S2CID  4318802.
  3. ^ Gorczyca, W; Bruno, S; Darzynkiewicz, R; Gong, J; Darzynkiewicz, Z (ноябрь 1992 г.). «Разрывы нитей ДНК, происходящие во время апоптоза — их раннее in situ обнаружение с помощью терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы и анализов трансляции ников и предотвращение с помощью ингибиторов сериновой протеазы». Int J Oncol . 1 (6): 639–48. doi :10.3892/ijo.1.6.639. PMID  21584593.
  4. ^ Gavrieli, Y.; Sherman, Y.; Ben-Sasson, SA (1992). «Идентификация запрограммированной клеточной смерти in situ с помощью специфической маркировки фрагментации ядерной ДНК». Журнал клеточной биологии . 119 (3): 493–501. doi :10.1083/jcb.119.3.493. PMC 2289665. PMID  1400587 . 
  5. ^ Николетти И, Мильорати Г, Паглиаччи М.С., Гриньяни Ф., Риккарди К. (3 июня 1991 г.). «Быстрый и простой метод измерения апоптоза тимоцитов с помощью окрашивания йодидом пропидия и проточной цитометрии». Журнал иммунологических методов . 139 (2): 271–279. doi :10.1016/0022-1759(91)90198-O. PMID  1710634.
  6. ^ Риккарди С, Николетти И (9 ноября 2006 г.). «Анализ апоптоза с помощью окрашивания пропидиум-йодидом и проточной цитометрии». Nature Protocols . 1 (3): 1458–1461. doi :10.1038/nprot.2006.238. PMID  17406435. S2CID  4469406.
  7. ^ Нагата, С.; Энари, М.; Сакахира, Х.; Ёкояма, Х.; Окава, К.; Ивамацу, А. (1998). «ДНКаза, активируемая каспазой, которая разрушает ДНК во время апоптоза, и ее ингибитор ICAD». Природа . 391 (6662): 43–50. Бибкод : 1998Natur.391...43E. дои : 10.1038/34112. PMID  9422506. S2CID  4407426.
  8. ^ Уильямсон, Роберт (1970-07-14). «Свойства быстро меченых фрагментов дезоксирибонуклеиновой кислоты, выделенных из цитоплазмы первичных культур эмбриональных клеток печени мыши». Журнал молекулярной биологии . 51 (1): 157–168. doi :10.1016/0022-2836(70)90277-9. ISSN  0022-2836. PMID  5481278.
  9. ^ ab Керр, Джон ФР; Уайли, Эндрю ; Карри, Аластер (август 1972 г.). «Апоптоз: базовый биологический феномен с широкими последствиями для кинетики тканей». British Journal of Cancer . 26 (4): 239–257. doi :10.1038/bjc.1972.33. ISSN  0007-0920. PMC 2008650. PMID  4561027 . 
  10. ^ Хьюиш, Дин Р.; Бергойн, Ли А. (1973-05-15). «Субструктура хроматина. Переваривание хроматиновой ДНК в регулярно расположенных участках ядерной дезоксирибонуклеазой». Biochemical and Biophysical Research Communications . 52 (2): 504–510. doi :10.1016/0006-291X(73)90740-7. ISSN  0006-291X. PMID  4711166.
  11. ^ Уильямс, Джерри Р.; Литтл, Джон Б.; Шипли, Уильям У. (1974-12-20). «Связь смерти клеток млекопитающих со специфической эндонуклеолитической деградацией ДНК». Nature . 252 (5485): 754–755. Bibcode :1974Natur.252..754W. doi :10.1038/252754a0. ISSN  0028-0836. PMID  4474604. S2CID  4181803.
  12. ^ Ceskova, M.; Matyásová, J; Cejková, M (1976-12-31). «ДНК в хроматине облученных лимфоидных тканей распадается in vivo на регулярные фрагменты». FEBS Letters . 72 (2): 271–274. Bibcode : 1976FEBSL..72..271S. doi : 10.1016/0014-5793(76)80984-2. ISSN  0014-5793. PMID  16386038. S2CID  579849.
  13. ^ Захарян, РА; Погосян, РГ (1978). «Глюкокортикоидная индукция деградации ДНК хроматина лимфоцитов на регулярно повторяющиеся фрагменты in vivo ». Доклады Академии наук Армянской ССР . 67 (2): 110–114. ISSN  0366-8606.КОД: DANAAW, CAN 90:115643 AN 1979:115643 CAPLUS (Авторское право 2003 ACS)
  14. ^ Chemical Abstracts v.90,1979;90:115643n стр.112.
  15. ^ Gavanji S, Bakhtari A, Famurewa AC, Othman EM (январь 2023 г.). «Цитотоксическая активность растительных лекарственных средств по оценке in vitro: обзор». Химия и биоразнообразие . 20 (2): 3–27. doi : 10.1002/cbdv.202201098 . PMID  36595710. S2CID  255473013.
  16. ^ Kajstura, M; Halicka, HD; Pryjma, J; Darzynkiewicz, Z (2007). «Прерывистая фрагментация ядерной ДНК во время апоптоза, выявленная дискретными пиками «sub-G1» на гистограммах содержания ДНК». Цитометрия A. 71 ( 3): 125–31. doi : 10.1002/cyto.a.20357 . PMID  17252584.
  17. ^ Wlodkowic, D; Telford, W; Skommer, J; Darzynkiewicz, Z (2011). «Апоптоз и дальше: цитометрия в исследованиях запрограммированной клеточной смерти». Последние достижения в цитометрии, часть B — достижения в приложениях . Методы в клеточной биологии. Том 103. Elsevier. стр. 55–98. doi :10.1016/B978-0-12-385493-3.00004-8. ISBN 9780123854933. PMC  3263828 . PMID  21722800. {{cite book}}: |journal=проигнорировано ( помощь )

Дальнейшее чтение