Секвенирование генома рака — это полное секвенирование генома одной, однородной или неоднородной группы раковых клеток. Это биохимический лабораторный метод для характеристики и идентификации последовательностей ДНК или РНК раковых клеток.
В отличие от секвенирования полного генома (WG), которое обычно проводится на основе клеток крови, таких как проекты секвенирования WG Дж. Крейга Вентера [ 1] и Джеймса Д. Уотсона [2] , слюны, эпителиальных клеток или костей, секвенирование генома рака включает прямое секвенирование первичной опухолевой ткани, прилегающей или дистальной нормальной ткани, микросреды опухоли, такой как фибробласты/стромальные клетки, или метастатических участков опухоли.
Подобно секвенированию всего генома, информация, полученная с помощью этого метода, включает: идентификацию нуклеотидных оснований (ДНК или РНК), количество копий и варианты последовательности, статус мутации и структурные изменения, такие как хромосомные транслокации и слияние генов .
Секвенирование генома рака не ограничивается секвенированием WG и может также включать экзомное , транскриптомное , микрономное секвенирование и профилирование конечной последовательности . Эти методы могут использоваться для количественной оценки экспрессии генов , экспрессии miRNA и идентификации альтернативных событий сплайсинга в дополнение к данным о последовательности.
Первый отчет о секвенировании генома рака появился в 2006 году. В этом исследовании было секвенировано 13 023 гена в 11 опухолях молочной железы и 11 опухолях толстой кишки. [3] Последующее исследование было опубликовано в 2007 году, где та же группа добавила чуть более 5 000 генов и почти 8 000 видов транскриптов для завершения экзомов 11 опухолей молочной железы и толстой кишки. [4] Первый полный геном рака, который был секвенирован, был получен от цитогенетически нормального острого миелоидного лейкоза Леем и др. в ноябре 2008 года. [5] Первая опухоль рака молочной железы была секвенирована Шахом и др. в октябре 2009 года, [6] первые опухоли легких и кожи — Плезансом и др. в январе 2010 года, [7] [8] и первые опухоли простаты — Бергером и др. в феврале 2011 года. [9]
Исторически сложилось так, что усилия по секвенированию генома раковых клеток делились на проекты секвенирования на основе транскриптома и усилия, сосредоточенные на ДНК.
Проект «Анатомия генома рака» (Cancer Genome Anatomy Project, CGAP) впервые был профинансирован в 1997 году [10] с целью документирования последовательностей транскриптов РНК в опухолевых клетках. [11] По мере совершенствования технологий CGAP расширил свои цели, включив в них определение профилей экспрессии генов раковых, предраковых и нормальных тканей. [12]
В 2003 году CGAP опубликовала самую большую общедоступную коллекцию тегов последовательностей, экспрессируемых при раке. [13]
Проект генома рака Института Сэнгера , впервые профинансированный в 2005 году, фокусируется на секвенировании ДНК. Он опубликовал перепись генов, причинно связанных с раком, [14] и ряд скринингов полного геномного секвенирования для генов, связанных с раком. [15]
Международный консорциум по геному рака (ICGC) был основан в 2007 году с целью интеграции имеющихся геномных , транскриптомных и эпигенетических данных из многих различных исследовательских групп. [16] [17] По состоянию на декабрь 2011 года ICGC включает 45 преданных делу проектов и располагает данными из 2961 генома рака. [16]
Процесс опухолеобразования, который трансформирует нормальную клетку в раковую, включает в себя ряд сложных генетических и эпигенетических изменений. [18] [19] [20] Выявление и характеристика всех этих изменений могут быть достигнуты с помощью различных стратегий секвенирования генома раковых клеток.
Сила секвенирования генома рака заключается в гетерогенности раковых заболеваний и пациентов. Большинство раковых заболеваний имеют множество подтипов, и в сочетании с этими «вариантами рака» существуют различия между подтипом рака у одного человека и у другого человека. Секвенирование генома рака позволяет врачам и онкологам определять специфические и уникальные изменения, которые претерпел пациент, чтобы развить свой рак. На основе этих изменений может быть разработана персонализированная терапевтическая стратегия. [21] [22]
Большой вклад в смертность от рака и неэффективность лечения рака вносит клональная эволюция на цитогенетическом уровне, например, как это наблюдается при остром миелоидном лейкозе (ОМЛ). [23] [24] В исследовании Nature, опубликованном в 2011 году, Дин и др. определили клеточные фракции, характеризующиеся общими мутационными изменениями, чтобы проиллюстрировать гетерогенность конкретной опухоли до и после лечения по сравнению с нормальной кровью у одного человека. [25]
Эти клеточные фракции могли быть идентифицированы только с помощью секвенирования генома раковой опухоли, что показало информацию, которую может предоставить секвенирование, а также сложность и гетерогенность опухоли у одного человека.
Два основных проекта, направленных на полную характеристику рака у отдельных лиц, в значительной степени включающую секвенирование, включают Cancer Genome Project , базирующийся в Wellcome Trust Sanger Institute, и Cancer Genome Atlas, финансируемый Национальным институтом рака (NCI) и Национальным институтом исследований генома человека (NHGRI). В сочетании с этими усилиями Международный консорциум по геному рака (более крупная организация) является добровольной научной организацией, которая предоставляет форум для сотрудничества между ведущими мировыми исследователями рака и геномики.
Целью Cancer Genome Projects является выявление вариантов последовательностей и мутаций, имеющих решающее значение для развития рака у человека. Проект включает систематический скрининг кодирующих генов и фланкирующих стыков сплайсинга всех генов в геноме человека на предмет приобретенных мутаций при раке у человека. Для исследования этих событий набор образцов для открытия будет включать ДНК из первичной опухоли, нормальной ткани (от тех же людей) и линий раковых клеток. Все результаты этого проекта объединяются и хранятся в базе данных рака COSMIC . COSMIC также включает мутационные данные, опубликованные в научной литературе.
TCGA — это многопрофильная работа по изучению молекулярной основы рака с помощью технологий анализа генома, включая методы крупномасштабного секвенирования генома. Сотни образцов собираются, секвенируются и анализируются. В настоящее время собираются раковые ткани из следующих областей: центральная нервная система, молочная железа, желудочно-кишечный тракт, гинекологические ткани, голова и шея, гематологические, грудные и урологические ткани.
Компоненты исследовательской сети TCGA включают: Biospecimen Core Resources, Genome Characterization Centers, Genome Sequencing Centers, Proteome Characterization Centers, Data Coordinating Center и Genome Data Analysis Centers. Каждый тип рака будет подвергнут комплексной геномной характеристике и анализу. Полученные данные и информация находятся в свободном доступе через портал данных TCGA проекта.
Целью ICGC является «получение всестороннего описания геномных, транскриптомных и эпигеномных изменений в 50 различных типах и/или подтипах опухолей, имеющих клиническое и социальное значение во всем мире» [16] .
Секвенирование генома рака использует ту же технологию, что и секвенирование всего генома. История секвенирования прошла долгий путь, возникнув в 1977 году двумя независимыми группами — методом ферментативного дидокси-секвенирования ДНК Фредерика Сэнгера [26] и методом химической деградации Аллена Максама и Уолтера Гилберта. [27] После этих знаковых работ, более 20 лет спустя, появилось «Второе поколение» высокопроизводительного секвенирования следующего поколения (HT-NGS), за которым в 2010 году последовала «Технология HT-NGS третьего поколения». [28] Рисунки справа иллюстрируют общий биологический конвейер и компании, участвующие во втором и третьем поколении секвенирования HT-NGS.
Три основные платформы второго поколения включают Roche/454 Pyro-sequencing , ABI/SOLiD sequencing путем лигирования и технологию секвенирования с амплификации моста Illumina . Три основные платформы третьего поколения включают Pacific Biosciences Single Molecule Real Time (SMRT) sequencing , Oxford Nanopore sequencing и Ion semiconductor sequencing .
Как и в любом проекте по секвенированию генома, риды должны быть собраны для формирования представления секвенируемых хромосом. В случае с геномами раковых клеток это обычно делается путем выравнивания ридов с референсным геномом человека .
Поскольку даже нераковые клетки накапливают соматические мутации, необходимо сравнить последовательность опухоли с соответствующей нормальной тканью, чтобы обнаружить, какие мутации являются уникальными для рака. В некоторых видах рака, таких как лейкемия, нецелесообразно сопоставлять образец рака с нормальной тканью, поэтому необходимо использовать другую нераковую ткань. [25]
Было подсчитано, что обнаружение всех соматических мутаций в опухоли потребует 30-кратного покрытия генома опухоли секвенированием и соответствующей нормальной ткани. [29] Для сравнения, первоначальный проект генома человека имел приблизительно 65-кратное покрытие. [30] Для содействия дальнейшему совершенствованию обнаружения соматических мутаций при раке Консорциум по контролю качества секвенирования фазы 2 создал пару линий опухолевых и нормальных клеток в качестве контрольных образцов сообщества и наборов данных для сравнительного анализа обнаружения мутаций рака. [31]
Основная цель секвенирования генома рака — идентификация мутаций драйверов: генетических изменений, которые увеличивают скорость мутаций в клетке, что приводит к более быстрой эволюции опухоли и метастазированию. [32] Трудно определить мутации драйверов только по последовательности ДНК; но драйверы, как правило, являются наиболее распространенными мутациями среди опухолей, группируются вокруг известных онкогенов и, как правило, не являются молчащими. [29] Мутации-пассажиры, которые не важны для прогрессирования заболевания, случайным образом распределены по всему геному. Было подсчитано, что средняя опухоль несет около 80 соматических мутаций, менее 15 из которых, как ожидается, являются драйверами. [33]
Анализ персональной геномики требует дальнейшей функциональной характеристики обнаруженных мутантных генов и разработки базовой модели происхождения и прогрессирования опухоли. Этот анализ может быть использован для выработки рекомендаций по фармакологическому лечению. [21] [22] По состоянию на февраль 2012 года это было сделано только для пациентов, прошедших клинические испытания, предназначенные для оценки подхода персональной геномики к лечению рака. [22]
Масштабный скрининг соматических мутаций в опухолях молочной железы и толстой кишки показал, что многие низкочастотные мутации вносят небольшой вклад в выживаемость клеток. [33] Если выживаемость клеток определяется множеством мутаций с небольшим эффектом, маловероятно, что секвенирование генома выявит единственную «ахиллесову пяту» для противораковых препаратов. Однако соматические мутации имеют тенденцию группироваться в ограниченном количестве сигнальных путей, [29] [33] [34], которые являются потенциальными целями лечения.
Раковые заболевания представляют собой гетерогенные популяции клеток. Когда данные о последовательности получены из целой опухоли, информация о различиях в последовательности и характере экспрессии между клетками теряется. [35] Эту трудность можно устранить с помощью анализа отдельных клеток.
Клинически значимые свойства опухолей, включая лекарственную устойчивость, иногда обусловлены крупномасштабными перестройками генома, а не единичными мутациями. [36] В этом случае информация о единичных нуклеотидных вариантах будет иметь ограниченную полезность. [35]
Секвенирование генома рака может быть использовано для предоставления клинически значимой информации у пациентов с редкими или новыми типами опухолей. Перевод информации о последовательности в клинический план лечения является очень сложным, требует экспертов из многих различных областей и не гарантирует, что приведет к эффективному плану лечения. [21] [22]
Инциденталома — это набор обнаруженных геномных вариантов, не связанных с изучаемым раком. [37] (Термин является игрой слов от слова incidentaloma , которое обозначает опухоли и новообразования, обнаруженные при визуализации всего тела по совпадению). [38] Обнаружение таких вариантов может привести к дополнительным мерам, таким как дальнейшее тестирование или управление образом жизни. [37]