Шевронный график — это способ представления кинетических данных сворачивания белка в присутствии различных концентраций денатуранта , который нарушает нативную третичную структуру белка . График известен как «шевронный» график из-за канонической v или формы шеврона, наблюдаемой при отображении логарифма наблюдаемой скорости релаксации в виде функции концентрации денатуранта.
В двухуровневой системе скорости сворачивания и разворачивания доминируют над наблюдаемыми скоростями релаксации ниже и выше средней точки денатурации (Cm). Это приводит к появлению терминологии «руки сворачивания и разворачивания» для конечностей шеврона. Априорная информация о Cm белка может быть получена из равновесных экспериментов. При подгонке к двухуровневой модели предполагается, что логарифм скоростей сворачивания и разворачивания линейно зависит от концентрации денатуранта, что приводит к наклонам m f и m u , называемым значениями m сворачивания и разворачивания соответственно (также называемыми кинетическими значениями m). Сумма двух скоростей является наблюдаемой скоростью релаксации. Соответствие между равновесным значением m и абсолютной суммой кинетических значений m обычно рассматривается как признак поведения с двумя состояниями. Большинство описанных экспериментов по денатурации были проведены при 298 К с мочевиной или хлоридом гуанидиния (GuHCl) в качестве денатурантов.
Для создания складчатой ветви шеврона белок в высококонцентрированном денатурирующем растворе быстро (менее чем за миллисекунду) разбавляется в соответствующем буфере до определенной концентрации денатуранта с помощью аппарата с остановленным потоком . Релаксация к новому равновесию отслеживается с помощью спектроскопических зондов, таких как флуоресценция, или реже с помощью кругового дихроизма (КД). Объем разбавления регулируется для получения скорости релаксации при определенной концентрации денатуранта. Конечная концентрация белка в смеси обычно составляет 1-20 мкМ в зависимости от ограничений, накладываемых амплитудой релаксации и соотношением сигнал/шум. Разворачивающаяся ветвь создается аналогичным образом путем смешивания белка без денатуранта с концентрированным денатурирующим раствором в буфере. Когда логарифм этих скоростей релаксации строится как функция конечной концентрации денатуранта, получается шевронный график.
Смешивание растворов определяет мертвое время прибора, которое составляет около миллисекунды. Поэтому аппарат с остановленным потоком может использоваться только для белков со временем релаксации в несколько миллисекунд. В случаях, когда время релаксации короче мертвого времени прибора, экспериментальная температура понижается (тем самым увеличивая вязкость воды /буфера), чтобы увеличить время релаксации до нескольких миллисекунд. С другой стороны, для быстросворачивающихся белков (т. е. тех, у которых скорость релаксации составляет от 1 до 100 микросекунд), скачок давления (мертвое время ~ несколько микросекунд), [1] скачок температуры (T-скачок; мертвое время ~ несколько наносекунд) или непрерывное перемешивание потока (мертвое время ~ несколько микросекунд), [2] могут быть выполнены при различных концентрациях денатуранта для получения шевронного графика.
Хотя предполагается, что ветви шеврона линейны с концентрацией денатуранта, это не всегда так. Нелинейности обычно наблюдаются либо в обеих ветвях, либо в одной из них и называются переворачиваниями шеврона. Причина такого наблюдения не ясна. Для объяснения этого поведения было предложено множество интерпретаций, включая промежуточные продукты на пути, [3] ограничения мертвого времени, движения переходного состояния ( эффект Хаммонда ), [4] артефакты агрегации, [ 5] сворачивание вниз [6] и эффекты Дебая-Хюккеля, вызванные солью [7] . Во многих случаях переворачивания ветвей при складывании игнорируются, поскольку они происходят при низких концентрациях денатуранта, и данные соответствуют двухуровневой модели с линейной зависимостью скоростей. Скорости сворачивания, сообщаемые для таких белков в отсутствие денатурантов, поэтому являются завышенными.