Путь cGAS–STING является компонентом врожденной иммунной системы , который функционирует для обнаружения присутствия цитозольной ДНК и, в ответ, запускает экспрессию воспалительных генов, которые могут привести к старению [1] или активации защитных механизмов. ДНК обычно находится в ядре клетки. Локализация ДНК в цитозоле связана с онкогенезом , вирусной инфекцией и вторжением некоторых внутриклеточных бактерий. [2] Путь cGAS–STING действует для обнаружения цитозольной ДНК и индукции иммунного ответа.
При связывании ДНК белок циклический ГМФ-АМФ- синтаза ( cGAS ) запускает реакцию ГТФ и АТФ с образованием циклического ГМФ-АМФ (cGAMP). cGAMP связывается со стимулятором генов интерферона ( STING ), который запускает фосфорилирование IRF3 через TBK1 . Затем IRF3 может перейти в ядро, чтобы запустить транскрипцию воспалительных генов. Этот путь играет решающую роль в опосредовании иммунной защиты от двухцепочечных ДНК- вирусов .
Врожденная иммунная система опирается на кодируемые зародышевой линией рецепторы распознавания образов (PRR) для распознавания различных патоген-ассоциированных молекулярных образцов (PAMP). При распознавании PAMP PRR генерируют каскады сигналов, приводящие к транскрипции генов, связанных с иммунным ответом. Поскольку все патогены используют нуклеиновую кислоту для размножения, ДНК и РНК могут распознаваться PRR для запуска иммунной активации. В нормальных клетках ДНК ограничена ядром или митохондриями . Присутствие ДНК в цитозоле указывает на повреждение клеток или инфекцию и приводит к активации генов, связанных с иммунным ответом. Один из способов обнаружения цитозольной ДНК — через путь cGAS/STING, в частности, с помощью циклической ГМФ-АМФ-синтазы (cGAS). При распознавании ДНК cGAS димеризуется и стимулирует образование циклической ГМФ-АМФ (cGAMP). Затем cGAMP напрямую связывается со стимулятором генов интерферона (STING), который запускает фосфорилирование/активацию фактора транскрипции IRF3 через TBK1. IRF3 способен проникать в ядро и стимулировать транскрипцию воспалительных генов, таких как IFN-β .
cGAS — это белок из 522 аминокислот и член семейства нуклеотидилтрансфераз . N-концевые остатки 1-212 необходимы для связывания dsDNA. Этот регион может содержать два различных домена связывания ДНК. C-концевые остатки 213-522 содержат часть мотива нуклеотидилтрансферазы (NTase) и домен Mab21 и высококонсервативны в cGAS от данио-рерио до человека. Эти регионы необходимы для формирования каталитического кармана для субстратов cGAS: GTP и ATP , а также для выполнения необходимой реакции циклизации. [3] [4] [5]
cGAS находится на плазматической мембране [6] и отвечает за обнаружение цитозольной двухцепочечной ДНК, обычно находящейся в ядре клетки, для стимуляции выработки IFN-β. cGAS также находится в ядре, где прочная связь с хроматином предотвращает его активацию собственной ДНК. [7] При прямом связывании цитозольной ДНК cGAS образует димеры для катализа выработки 2'3'-cGAMP из АТФ и ГТФ. Затем cGAMP действует как вторичный мессенджер, связываясь со STING, чтобы вызвать активацию фактора транскрипции IRF3. IRF3 приводит к транскрипции IFN-β типа 1. cGAS не способен вырабатывать 2'3'-cGAMP в присутствии РНК.
До открытия cGAS было известно, что интерферон бета вырабатывается в присутствии цитозольной dsDNA и что клетки с дефицитом STING не способны вырабатывать интерферон в присутствии dsDNA. С помощью биохимического фракционирования клеточных экстрактов и количественной масс-спектрометрии Сан и др. [8] идентифицировали cGAS как ДНК-чувствительный белок, способный запускать интерферон бета путем синтеза вторичного мессенджера, 2'3'-cGAMP. Эта активность зависит от цитозольной ДНК.
cGAS катализирует образование cGAMP в присутствии dsDNA. cGAS напрямую связывает dsDNA через положительно заряженные аминокислотные остатки, взаимодействующие с отрицательно заряженным фосфатным остовом ДНК. Мутации в положительно заряженных остатках полностью отменяют связывание ДНК и последующее производство интерферона через STING. После связывания dsDNA cGAS димеризуется и претерпевает конформационные изменения, которые открывают каталитический карман связывания нуклеотидов, позволяя войти GTP и ATP . Здесь они стабилизируются посредством укладки оснований, водородных связей и двухвалентных катионов, чтобы катализировать образование фосфодиэфирной связи для получения циклического динуклеотида cGAMP.
Циклический GMP-AMP (cGAMP) является циклическим динуклеотидом (CDN) и первым, обнаруженным у метазоа. Другие CDN (c-di-GMP и c-di-AMP) обычно встречаются у бактерий, архей и простейших. Как следует из названия, cGAMP является циклической молекулой, состоящей из одного аденинмонофосфата (AMP) и одного гуанинмонофосфата (GMP), соединенных двумя фосфодиэфирными связями. Однако cGAMP отличается от других CDN тем, что он содержит уникальные фосфодиэфирные связи между 2' OH GMP и 5' фосфатом AMP. [9] Другая связь находится между 3' OH AMP и 5' фосфатом GMP. Уникальная 2'-5' фосфодиэфирная связь может быть выгодной, поскольку она менее подвержена деградации, вызванной 3'-5' фосфодиэстеразами. Другим преимуществом уникальной связи 2'-5' может быть то, что cGAMP способен связывать множественные аллельные варианты STING, обнаруженные в человеческой популяции, в то время как другие CDN, состоящие только из связей 3'-5', не способны на это.
cGAMP был открыт Zhijian "James" Chen и коллегами [11] путем сбора цитоплазматических экстрактов из клеток, трансфицированных различными типами ДНК. Клеточные экстракты были проанализированы на активацию STING путем обнаружения активированных димеров IRF3. С помощью хроматографии аффинной очистки было очищено активирующее вещество STING, а масс-спектрометрия была использована для идентификации вещества как циклического GMP-AMP (cGAMP).
Было показано, что химически синтезированный cGAMP запускает активацию IRF3 и выработку IFN-β. Было обнаружено, что cGAMP гораздо более эффективен, чем другие циклические динуклеотиды (c-di-GMP и c-di-AMP). Было показано, что cGAMP окончательно связывает STING с помощью радиоактивно меченого cGAMP, сшитого со STING. Было обнаружено, что добавление немеченого cGAMP, c-di-GMP или c-di-AMP конкурирует с радиоактивно меченым cGAMP, что предполагает перекрытие участков связывания CDN. Позже было показано, что cGAMP имеет уникальную 2'-5' фосфодиэфирную связь, которая отличается от обычных 3'-5' связанных CDN, и что эта связь может объяснить некоторые уникальные сигнальные свойства cGAMP. [9]
STING — это резидентный белок эндоплазматического ретикулума , который, как было показано, напрямую связывается с различными циклическими динуклеотидами, такими как циклический аденозин-инозинмонофосфат . [9]
STING широко экспрессируется в многочисленных типах тканей как иммунного, так и неиммунного происхождения. [12] STING был обнаружен в мышиных эмбриональных фибробластах и необходим для реакции интерферона типа 1 как в иммунных, так и в неиммунных клетках. [13]
STING — это белок из 378 аминокислот. Его N-концевая область (остатки 1-154) содержит четыре трансмембранных домена. Его C-концевой домен содержит домен димеризации, домен взаимодействия циклических динуклеотидов, а также домен, отвечающий за взаимодействие и активацию TBK1. При связывании 2'-3' cGAMP STING претерпевает значительное конформационное изменение (приблизительно 20 ангстрем внутреннего вращения), которое охватывает cGAMP.
При связывании 2'-3' cGAMP (и других бактериальных CDN) STING активирует TBK1 для фосфорилирования нижестоящих факторов транскрипции IRF3, который индуцирует ответ IFN типа 1, и STAT6 , который индуцирует хемокины, такие как CCL2 и CCL20 , независимо от IRF3. [15] Также считается, что STING активирует фактор транскрипции NF-κB посредством активности киназы IκB (IKK), хотя механизм активации NF-κB нижестоящего STING еще предстоит определить. Сигнальные пути, активируемые STING, объединяются, чтобы индуцировать врожденный иммунный ответ на клетки с эктопической ДНК в цитозоле. Потеря активности STING подавляет способность эмбриональных фибробластов мыши бороться с инфекцией определенными вирусами и, в более общем плане, необходима для ответа IFN типа 1 на введенную цитозольную ДНК. [13]
Предполагается, что общая роль STING как молекулы-адаптера в цитозольном ответе IFN ДНК-типа 1 в разных типах клеток функционирует через дендритные клетки (DC). DC связывают врожденную иммунную систему с адаптивной иммунной системой посредством фагоцитоза и презентации MHC чужеродного антигена. Ответ IFN типа 1, инициируемый DC, возможно, посредством распознавания фагоцитированной ДНК, [16] имеет важный костимулирующий эффект. Это недавно привело к предположению, что 2'-3' cGAMP может быть использован в качестве более эффективного и прямого адъюванта, чем ДНК, для индукции иммунных ответов.
Естественные вариации человеческого STING (hSTING) были обнаружены в аминокислотной позиции 232 (R232 и H232). Варианты H232 снижают реакцию IFN типа 1 [17] , а мутация в этой позиции на аланин отменяет реакцию на бактериальные CDN. Также были обнаружены замены, усиливающие связывание лиганда. Было показано, что замены G230A увеличивают сигнализацию hSTING при связывании c-di-GMP. Этот остаток находится на крышке связывающего кармана, возможно, увеличивая способность связывания c-di-GMP. [18]
Путь cGAS-cGAMP-STING способен генерировать интерферон бета в ответ на цитозольную ДНК. Было показано, что ДНК-вирусы, такие как HSV-1, способны запускать выработку cGAMP и последующую активацию интерферона бета через STING. РНК-вирусы, такие как вирус VSV или вирус Сендай , не способны запускать интерферон через cGAS-STING. Мыши с дефектом cGAS или STING не способны вырабатывать интерферон в ответ на инфекцию HSV-1, что в конечном итоге приводит к смерти, в то время как мыши с нормальной функцией cGAS и STING способны выздоравливать.
Ретровирусы, такие как ВИЧ-1, также, как было показано, активируют IFN через путь cGAS/STING. В этих исследованиях ингибиторы ретровирусной обратной транскрипции отменили продукцию IFN, что предполагает, что именно вирусная ДНК активирует cGAS. [19]
Путь cGAS/STING также играет роль в наблюдении за опухолями. В ответ на клеточный стресс, такой как повреждение ДНК, клетки будут повышать регуляцию лигандов NKG2D , чтобы они могли быть распознаны и уничтожены естественными киллерами (NK) и Т-клетками . Во многих опухолевых клетках реакция на повреждение ДНК является конститутивно активной, что приводит к накоплению цитоплазматической ДНК. Это активирует путь cGAS/STING, что приводит к активации IRF3. Было показано, что в клетках лимфомы лиганд NKG2D, Rae1, был повышен в зависимости от STING/IRF3. Трансфекция ДНК в эти клетки также запускала экспрессию Rae1, которая зависела от STING. В этой модели фактор транскрипции IRF3 через cGAS/STING повышает регуляцию лигандов, вызванных стрессом, таких как Rae1, в опухолевых клетках, чтобы способствовать NK-опосредованному очищению опухоли. [20] Более того, было показано, что активация пути STING в макрофагах костного мозга подавляет рост клеток острого миелоидного лейкоза в моделях на мышах. [21]
Цитоплазматическая ДНК из-за вирусной инфекции может привести к активации интерферона бета, чтобы помочь избавиться от инфекции. Однако хроническая активация STING из-за ДНК хозяина в цитозоле также может активировать путь cGAS/STING, что приводит к аутоиммунным расстройствам. Примером этого является синдром Айкарди-Гутьера (AGS). Мутации в 3'-репарационной экзонуклеазе, TREX1, вызывают накопление эндогенных ретроэлементов в цитозоле, что может привести к активации cGAS/STING, что приводит к продукции IFN. Избыточная продукция IFN приводит к чрезмерной активности иммунной системы, что приводит к AGS и другим иммунным расстройствам. У мышей было обнаружено, что аутоиммунные симптомы, связанные с дефицитом TREX1, облегчались при нокауте cGAS, STING или IRF3, что подразумевает важность аберрантного считывания ДНК при аутоиммунных расстройствах. [19]
Было показано, что истощение cGAS и STING в эмбриональных фибробластах мышей и в первичных фибробластах человека предотвращает старение и установление SASP ( секреторного фенотипа, связанного со старением ). [22] [1]
Было показано, что ДНК является мощным адъювантом для усиления иммунного ответа на антигены, кодируемые вакцинами. cGAMP, посредством активации STING IRF3, стимулирует транскрипцию интерферона. Это делает cGAMP потенциальным адъювантом вакцины, способным усиливать воспалительные реакции. [9] Исследования показали, что вакцины, кодируемые куриным антигеном, овальбумином (OVA), в сочетании с cGAMP, способны активировать антигенспецифические Т- и В-клетки в зависимости от STING in vivo. При стимуляции пептидом OVA было показано, что Т-клетки мышей, вакцинированных OVA + cGAMP, имеют повышенный IFN-g и IL-2 по сравнению с животными, получавшими только OVA. [23] Кроме того, повышенная стабильность cGAMP из-за уникальной 2'-5' фосфодиэфирной связи может сделать его предпочтительным адъювантом ДНК для применения in vivo.