Диско -диффузионный тест (также известный как тест диффузии в агаре , тест Кирби-Бауэра , диско-диффузионный тест на чувствительность к антибиотикам , диско-диффузионный тест на чувствительность к антибиотикам и тест KB ) — это микробиологический анализ на основе культуры , используемый в диагностических и исследовательских лабораториях по разработке лекарственных препаратов . В диагностических лабораториях анализ используется для определения восприимчивости бактерий, выделенных из инфекционных очагов пациента, к клинически одобренным антибиотикам. Это позволяет врачам назначать наиболее подходящее лечение антибиотиками. [1] [2] [4] [5] В лабораториях по разработке лекарственных препаратов, особенно в лабораториях биоразведки , анализ используется для скрининга биологического материала (например, растительных экстрактов, бульонов бактериальной ферментации) и кандидатов на лекарственные препараты на антибактериальную активность. При биоразведке анализ может проводиться с парными штаммами бактерий для достижения дерепликации и предварительной идентификации антибактериального механизма действия . [6] [7]
В диагностических лабораториях тест проводится путем инокуляции поверхности агаровой пластины бактериями, выделенными из инфекции пациента. Затем на агар наносятся бумажные диски, содержащие антибиотики, и пластина инкубируется. Если антибиотик останавливает рост бактерий или убивает их , вокруг диска будет область, где бактерии не выросли достаточно, чтобы быть видимыми. Это называется зоной ингибирования. Восприимчивость бактериального изолята к каждому антибиотику затем может быть полуколичественно определена путем сравнения размера этих зон ингибирования с базами данных информации об известных восприимчивых к антибиотикам, умеренно восприимчивых и устойчивых бактериях. Таким образом, можно определить наиболее подходящий антибиотик для лечения инфекции пациента. [1] [2] Хотя диско-диффузионный тест не может быть использован для дифференциации бактериостатической и бактерицидной активности, он менее громоздкий, чем другие методы тестирования восприимчивости, такие как разбавление бульона . [4]
В лабораториях по разработке лекарственных препаратов диско-диффузионный тест выполняется несколько иначе, чем в диагностических лабораториях. В этой обстановке необходимо охарактеризовать не бактериальный штамм, а тестовый экстракт (например, растительный или микробный экстракт). Поэтому пластина агара инокулируется бактериальным штаммом известного фенотипа (часто штаммом ATCC или NCTC ), а диски, содержащие тестовый экстракт, наносятся на поверхность. [6] Размеры зон ингибирования не могут использоваться в качестве полуколичественной меры антибактериальной активности, поскольку разные экстракты содержат молекулы с разными диффузионными характеристиками (разные молекулярные размеры , гидрофильность и т. д.). Однако размеры зон ингибирования можно использовать для целей дерепликации. Это достигается путем тестирования каждого экстракта против парных штаммов бактерий (например, восприимчивых и устойчивых к стрептомицину штаммов для идентификации экстрактов, содержащих стрептомицин). Парные штаммы (например, дикий тип и целевые сверхэкспрессирующие штаммы) также могут использоваться для идентификации антибактериального механизма действия. [6] [7]
Агаровая диффузия была впервые использована Мартинусом Бейеринком в 1889 году для изучения влияния ауксинов на рост бактерий. Однако этот метод был разработан, усовершенствован и стандартизирован многими учеными и научными организациями на протяжении многих лет, включая Джорджа Ф. Реддиша, Нормана Хитли , Джеймса Г. Винсента, [8] Альфреда В. Бауэра, Уильяма М. М. Кирби, Джона К. Шерриса , [4] [5] Ганса Мартина Эрикссона, Всемирную организацию здравоохранения , Институт клинических и лабораторных стандартов , Шведскую референтную группу по антибиотикам, Немецкий институт нормирования , Британское общество антимикробной химиотерапии и других. [8]
Чистая бактериальная культура суспендируется в физиологическом растворе, ее мутность стандартизируется, и она равномерно наносится тампоном на агаровую пластину. Затем на поверхность агара помещается пропитанный антибиотиком или экстрактом диск фильтровальной бумаги. Компоненты диска диффундируют из фильтровальной бумаги в агар. Концентрация этих компонентов будет самой высокой рядом с диском и будет уменьшаться по мере увеличения расстояния от диска. Если антибиотик или экстракт эффективен против бактерий в определенной концентрации, колонии не будут расти там, где концентрация в агаре больше или равна эффективной концентрации. Это зона ингибирования. В целом, более крупные зоны ингибирования коррелируют с более низкими минимальными ингибирующими концентрациями (МИК) антибиотика или экстракта для этого штамма бактерий. [1] Исключением из этого правила является случай, когда молекулы антибиотика или экстракта большие или гидрофобные, поскольку они медленно диффундируют через агар. [6]
Все аспекты процедуры Кирби-Бауэра стандартизированы для обеспечения последовательных и точных результатов. По этой причине лаборатория должна придерживаться этих стандартов. Среда, используемая в тесте Кирби-Бауэра, должна представлять собой агар Мюллера-Хинтона глубиной всего 4 мм, налитый в чашки Петри диаметром 100 мм или 150 мм. Уровень pH агара должен быть между 7,2 и 7,4. Бактериальный инокулят готовится путем разбавления бульонной культуры до соответствия стандарту мутности Макфарланда 0,5 , что эквивалентно приблизительно 150 миллионам клеток на мл. [1]
Используя асептическую технику , бульонную культуру определенного организма собирают стерильным тампоном . В случае грамотрицательных бактерий избыток жидкости удаляют с тампона, осторожно нажимая или вращая его против внутренней части пробирки. Затем тампон наносят штрихом на пластину агара Мюллера-Хинтона, чтобы сформировать бактериальный газон. Чтобы получить равномерный рост, пластину агара наносят штрихом тампоном в одном направлении, поворачивают на 120° и снова наносят штрихом, поворачивают еще на 120° и снова наносят штрихом. Затем с помощью дозатора дисков с антибиотиками на пластину наносят диски, содержащие определенные антибиотики. Это необходимо сделать в течение 15 минут после инокуляции. Стерилизованные в пламени щипцы используются для осторожного нажатия каждого диска на агар и обеспечения его прикрепления. Затем пластины инкубируют в течение ночи, обычно при температуре 35 °C. Пластины необходимо инкубировать в течение 15 минут после нанесения дисков с антибиотиками. [1]
Было разработано несколько вариантов метода диск-диффузии, включая методы Оксфордской пенициллиновой чашки и Etest, используемые в диагностических лабораториях больниц, [9] [10] а также методы диффузии в лунках, диффузии в цилиндрах и биоавтографические методы, используемые в лабораториях по исследованию и разработке лекарственных препаратов. [6] [11]
Диски, содержащие возрастающие концентрации антибиотиков, помещаются на засеянный бактериальный газон на поверхности агара, и чашки инкубируются. Размеры зон измеряются от края диска до конца чистой зоны. Интерпретация более сложна в популяциях со смешанной восприимчивостью. Они нанесены на график как линейные размеры или квадраты расстояний как функция натурального логарифма концентрации антибиотика в дисках. МИК определяется из нулевого отрезка линейной регрессии, подогнанной через данные. [12] Сам отрезок является логарифмом МИК. Наклон линии регрессии связан с коэффициентом диффузии этого конкретного антибиотика в агаре. [9]
![Впервые диффузия в агар была использована в 1889 году Мартинусом Бейеринком.[8]](http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/5/51/Martinus_Willem_Beijerinck.png/1280px-Martinus_Willem_Beijerinck.png)
