stringtranslate.com

Дитиотреитол

Дитиотреитол ( ДТТ ) представляет собой сераорганическое соединение формулы (CH(OH)CH 2 SH) 2 . Бесцветное соединение, классифицируется как дитиол и диол . DTT — это окислительно-восстановительный реагент, также известный как реагент Клеланда , в честь У. Уоллеса Клеланда . [2] Реагент обычно используется в рацемической форме. Его название происходит от четырехуглеродного сахара – треозы . ДТТ имеет эпимерное («сестринское») соединение дитиоэритрит (ДТЕ).

Восстановитель

ДТТ – восстановитель ; после окисления он образует стабильное шестичленное кольцо с внутренней дисульфидной связью . Он имеет окислительно-восстановительный потенциал -0,33 В при pH 7. [1] Восстановление типичной дисульфидной связи происходит за счет двух последовательных реакций тиол-дисульфидного обмена и проиллюстрировано ниже. Восстановление обычно не останавливается на смешанных дисульфидных соединениях, поскольку второй тиол ДТТ имеет высокую склонность замыкать кольцо, образуя окисленный ДТТ и оставляя после себя восстановленную дисульфидную связь . Восстанавливающая способность DTT ограничена значениями pH выше 7, поскольку только отрицательно заряженная тиоловая форма -S - является реакционноспособной (протонированная тиоловая форма -SH - нет); рКа тиоловых групп составляет 9,2 и 10,1 .

Восстановление типичной дисульфидной связи ДТТ посредством двух последовательных реакций тиол-дисульфидного обмена .

Приложения

ДТТ используется в качестве восстанавливающего или «снимающего защиту» агента для тиолированной ДНК. Концевые атомы серы тиолированной ДНК имеют тенденцию образовывать димеры в растворе, особенно в присутствии кислорода. Димеризация значительно снижает эффективность последующих реакций сочетания, таких как иммобилизация ДНК на золоте в биосенсорах. Обычно ДТТ смешивают с раствором ДНК и дают ему прореагировать, а затем удаляют фильтрованием (для твердого катализатора) или хроматографией ( для жидкой формы). Процедуру удаления DTT часто называют «обессоливанием». Обычно ДТТ используется в качестве защитного агента, предотвращающего окисление тиоловых групп .

ДТТ часто используется для восстановления дисульфидных связей белков и , в более общем плане, для предотвращения образования внутримолекулярных и межмолекулярных дисульфидных связей между цистеиновыми остатками белков. Однако даже ДТТ не может восстановить скрытые (недоступные растворителю) дисульфидные связи, поэтому восстановление дисульфидных связей иногда проводят в денатурирующих условиях (например, при высоких температурах или в присутствии сильного денатуратора, такого как 6 М хлорид гуанидиния , 8 М мочевина , или 1% додецилсульфат натрия ). ДТТ часто используется вместе с додецилсульфатом натрия в SDS-PAGE для дальнейшей денатурации белков за счет восстановления их дисульфидных связей, чтобы обеспечить лучшее разделение белков во время электрофореза . Благодаря способности восстанавливать дисульфидные связи ДТТ можно использовать для денатурации CD38 эритроцитов. DTT также денатурирует антигены в системах групп крови Келла, Лютера, Домброка, Кромера, Картрайта, LW и Кнопса. И наоборот, воздействие растворителя на различные дисульфидные связи можно оценить по скорости их восстановления в присутствии ДТТ.

ДТТ также может использоваться в качестве окислителя . Его основное преимущество заключается в том, что в отличие от других агентов, таких как глутатион , практически не заселяются виды смешанных дисульфидов . В очень редких случаях может образовываться аддукт ДТТ , т. е. два атома серы ДТТ могут образовывать дисульфидные связи с разными атомами серы; в таких случаях DTT не может циклизироваться, поскольку у него не осталось свободных тиолов.

Характеристики

ДТТ окисляется воздухом. Поэтому его обычно хранят и обрабатывают в инертной атмосфере, чтобы минимизировать окисление. Скорость окисления воздухом замедляется при низких температурах. [3] Окисленный ДТТ демонстрирует сильный пик поглощения при 280 нм. Поскольку тиолы менее нуклеофильны, чем их конъюгированные основания, тиолаты , ДТТ становится менее сильным нуклеофилом при падении pH. (2 S )-2-Амино-1,4-димеркаптобутан ( дитиобутиламин или DTBA), родственный дитиол-восстанавливающий агент, в некоторой степени преодолевает это ограничение DTT. [4] Трис(2-карбоксиэтил)фосфин ( TCEP ) является альтернативным восстановителем, который более стабилен и эффективен при низком pH, но он громоздкий и восстанавливает цистины в свернутых белках лишь медленно. [5]

Период полураспада ДТТ составляет 40 часов при pH 6,5 и 1,4 часа при pH 8,5 и 20 °C; его период полураспада уменьшается с повышением температуры. Присутствие ЭДТА (этилендиаминтетрауксусной кислоты) для хелатирования ионов двухвалентных металлов значительно продлевает период полураспада ДТТ в растворе. [6]

Смотрите также

Рекомендации

  1. ^ Аб О'Нил MJ, изд. (2001). Индекс Merck: энциклопедия химических веществ, лекарств и биологических препаратов (13-е изд.). США: ISBN компании Merck & Co, Inc. 0-911910-13-1.
  2. ^ Клеланд WW (апрель 1964 г.). «Дитиотреитол, новый защитный реагент для SH-групп». Биохимия . 3 (4): 480–2. дои : 10.1021/bi00892a002. ПМИД  14192894.
  3. ^ «Индекс CID NLM PubChem», Справочник по витамину D , John Wiley & Sons, Inc., стр. 239–244, 2007, doi : 10.1002/9780470238165.indsp1 , ISBN 978-0-470-23816-5
  4. ^ Лукеш Дж.К., Палте MJ, Рейнс RT (март 2012 г.). «Мощный, универсальный дисульфид-восстанавливающий агент из аспарагиновой кислоты». Журнал Американского химического общества . 134 (9): 4057–9. дои : 10.1021/ja211931f. ПМЦ 3353773 . ПМИД  22353145. 
  5. ^ Клайн DJ, Реддинг С.Э., Брохон С.Г., Псатас Дж.Н., Шнайдер Дж.П., Торп С. (декабрь 2004 г.). «Новые водорастворимые фосфины как восстановители дисульфидных связей пептидов и белков: реакционная способность и мембранная проницаемость». Биохимия . 43 (48): 15195–203. дои : 10.1021/bi048329a. ПМИД  15568811.
  6. ^ Стивенс Р., Стивенс Л., Прайс, Северная Каролина (1983). «Стабильность различных тиоловых соединений, используемых при очистке белков». Биохимическое образование . 11 (2): 70. дои :10.1016/0307-4412(83)90048-1.

Внешние ссылки