Фосмиды похожи на космиды , но основаны на бактериальной F-плазмиде . Вектор клонирования ограничен, так как хозяин (обычно E. coli ) может содержать только одну молекулу фосмиды. Фосмиды могут содержать вставки ДНК размером до 40 кб; часто источником вставки является случайная геномная ДНК. Библиотека фосмид готовится путем извлечения геномной ДНК из целевого организма и клонирования ее в вектор фосмиды. [1] Затем лигатурная смесь упаковывается в фаговые частицы, а ДНК трансфицируется в бактериального хозяина. Бактериальные клоны размножают библиотеку фосмид. Низкое число копий обеспечивает более высокую стабильность, чем векторы с относительно большим числом копий, включая космиды. Фосмиды могут быть полезны для построения стабильных библиотек из сложных геномов . Фосмиды обладают высокой структурной стабильностью и, как было обнаружено, эффективно сохраняют человеческую ДНК даже после 100 поколений бактериального роста. [2] Клоны Fosmid использовались для оценки точности публичной последовательности генома человека. [3]
Плазмида фертильности или F-плазмида была открыта Эстер Ледерберг и кодирует информацию для биосинтеза половых пилей для помощи в бактериальной конъюгации. Конъюгация включает использование половых пилей для формирования моста между двумя бактериальными клетками; этот мост позволяет клетке F+ передавать одноцепочечную копию плазмиды так, чтобы обе клетки содержали копию плазмиды. На пути в клетку-реципиент соответствующая цепь ДНК синтезируется реципиентом. Донорская клетка сохраняет функциональную копию плазмиды. Позже было обнаружено, что фактор F был первой эписомой и может существовать как независимая плазмида, что делает его очень стабильным вектором для клонирования. Конъюгация помогает в формировании библиотек бактериальных клонов, гарантируя, что все клетки содержат желаемую фосмиду. [4]
Fosmids — это векторы ДНК, которые используют F-плазмидный источник репликации и механизмы разделения, чтобы обеспечить клонирование больших фрагментов ДНК. Библиотека, которая обеспечивает 20–70-кратное избыточное покрытие генома, может быть легко подготовлена. [5]
Первым шагом в секвенировании целых геномов является клонирование генома в управляемые единицы длиной около 50-200 килобаз. Идеально использовать библиотеку фосмидов из-за ее стабильности и ограничения одной плазмиды на клетку. Ограничивая количество плазмид в клетках, снижается потенциал рекомбинации, тем самым сохраняя вставку генома. [6]
Фосмиды содержат несколько функциональных элементов:
Методы разрезания и вставки ДНК в фосмидные векторы были усовершенствованы. Сейчас существует много компаний, которые могут создать библиотеку фосмид из любого образца ДНК за очень короткий промежуток времени и при относительно низкой стоимости. Это было жизненно важно для того, чтобы позволить исследователям секвенировать многочисленные геномы для изучения. С помощью различных методов были полностью секвенированы геномы более 6651 организмов, и 58 695 продолжают секвенироваться. [7]
Иногда бывает трудно точно различить отдельные хромосомы на основе длины хромосомы, соотношения плеч и рисунка C-бэндинга. Фосмиды можно использовать в качестве надежных цитологических маркеров для индивидуальной идентификации хромосом, а кариотипы метафазных хромосом, основанные на флуоресцентной гибридизации in situ, можно использовать для того, чтобы показать, были ли успешно сконструированы положения этих фосмид. [8]
Система fosmid отлично подходит для быстрого создания хромосомно-специфичных мини-BAC-библиотек из хромосомной ДНК, отсортированной потоком. Главное преимущество Fosmids перед другими космидными системами заключается в их способности стабильно размножать фрагменты человеческой ДНК. [9] Высокоповторяющаяся по своей природе, человеческая ДНК хорошо известна своей крайней нестабильностью в многокопийных векторных системах. Было обнаружено, что стабильность резко возрастает, когда вставки человеческой ДНК присутствуют в единичных копиях в клетках E. coli с дефицитом рекомбинации . Поэтому Fosmids служат надежными субстратами для крупномасштабного геномного секвенирования ДНК. [2]