Primer walk — это метод, используемый для клонирования гена (например, гена заболевания) из его известных ближайших маркеров (например, известного гена). В результате он используется в клонировании и секвенировании растений, грибов и млекопитающих с незначительными изменениями. Этот метод, также известный как «направленное секвенирование», использует серию реакций секвенирования по Сэнгеру для подтверждения референтной последовательности известной плазмиды или продукта ПЦР на основе референтной последовательности (услуга подтверждения последовательности) или для обнаружения неизвестной последовательности полной плазмиды или продукта ПЦР путем проектирования праймеров для секвенирования перекрывающихся участков (услуга обнаружения последовательностей). [1]
Primer walk — это метод определения последовательности ДНК размером до 1,3–7,0 кб, тогда как хромосомный walk используется для получения клонов уже известных последовательностей гена. [2] Слишком длинные фрагменты не могут быть секвенированы в одной последовательности, прочитанной с помощью метода терминации цепи . Этот метод работает путем деления длинной последовательности на несколько последовательных коротких. Интересующая ДНК может быть плазмидной вставкой, продуктом ПЦР или фрагментом, представляющим собой пробел при секвенировании генома. Термин «праймерный walk» используется, когда основной целью является секвенирование генома. Термин «хромосомный walk» используется вместо этого, когда последовательность известна, но нет клона гена. Например, ген заболевания может быть расположен рядом с определенным маркером, таким как RFLP на последовательности. [3] Прогулка по хромосоме — это метод, используемый для клонирования гена (например, гена болезни) из его известных ближайших маркеров (например, известного гена) и, следовательно, используется в умеренных модификациях в проектах клонирования и секвенирования у растений, грибов и животных. Другими словами, он используется для поиска, изоляции и клонирования определенной последовательности, существующей рядом с геном, который необходимо отобразить. Библиотеки больших фрагментов, в основном бактериальные искусственные библиотеки хромосом, в основном используются в геномных проектах. Чтобы идентифицировать нужную колонию и выбрать конкретный клон, библиотека сначала скринируется с помощью нужного зонда. После скрининга клон перекрывается зондом, и перекрывающиеся фрагменты картируются. Затем эти фрагменты используются в качестве нового зонда (короткие фрагменты ДНК, полученные из 3′ или 5′ концов клонов) для идентификации других клонов. Библиотека состоит приблизительно из 96 клонов, и каждый клон содержит другую вставку. Зонд один идентифицирует λ1 и λ2, поскольку он перекрывает их. Зонд два, полученный из клонов λ2, используется для идентификации λ3 и т. д. Ориентация клонов определяется рестрикционным картированием клонов. Таким образом, можно идентифицировать новые хромосомные регионы, присутствующие вблизи гена. Прогулка по хромосоме занимает много времени, и метод выбора для идентификации гена — посадка хромосомы. Этот метод требует обнаружения маркера, который прочно связан с мутантным локусом. [4]
Сначала фрагмент секвенируется, как если бы это был более короткий фрагмент. Секвенирование выполняется с каждого конца с использованием либо универсальных праймеров , либо специально разработанных. Это должно идентифицировать первые 1000 или около того оснований. Для того чтобы полностью секвенировать интересующую область, необходимо разработать и синтезировать новые праймеры (комплементарные последним 20 основаниям известной последовательности) для получения непрерывной информации о последовательности. [5]
Primer walking является примером направленного секвенирования , поскольку праймер разрабатывается из известного региона ДНК, чтобы направлять секвенирование в определенном направлении. В отличие от направленного секвенирования, дробовик секвенирования ДНК является более быстрой стратегией секвенирования. [6]
Существует метод из «старых времен» секвенирования генома. Базовый метод секвенирования — метод терминации цепи Сэнгера, который может иметь длину считывания от 100 до 1000 пар оснований (в зависимости от используемых инструментов). Это означает, что вам нужно разбить более длинные молекулы ДНК, клонировать и затем секвенировать их. Возможны два метода. [7]
Первый называется хромосомным (или праймерным) хождением и начинается с секвенирования первой части. Затем следующий (смежный) кусок последовательности секвенируется с использованием праймера, который комплементарен концу первой прочитанной последовательности и так далее. Этот метод не требует большой сборки, но вам нужно много праймеров, и он относительно медленный. [8]
Для решения этой проблемы был разработан метод дробового секвенирования. Здесь ДНК разбивается на разные части (не все в одном месте), клонируется и секвенируется с праймерами, специфичными для вектора, используемого для клонирования. Это приводит к перекрывающимся последовательностям, которые затем должны быть собраны в одну последовательность на компьютере. Этот метод позволяет распараллеливать секвенирование (вы можете подготовить много реакций секвенирования одновременно и запустить их), что делает процесс намного быстрее, а также избегает необходимости в праймерах, специфичных для последовательности. Задача состоит в том, чтобы организовать последовательности в их порядке, поскольку перекрытия здесь не так очевидны. Чтобы решить эту проблему, делается первый черновик, а затем критические области повторно секвенируются с использованием других методов, таких как прогулка по праймеру. [9]
Общий процесс выглядит следующим образом: праймер , который соответствует началу ДНК для последовательности, используется для синтеза короткой цепи ДНК, смежной с неизвестной последовательностью, начиная с праймера (см. ПЦР ). Новая короткая цепь ДНК секвенируется с использованием метода терминации цепи. Конец секвенированной цепи используется в качестве праймера для следующей части длинной последовательности ДНК, отсюда и термин «прогулка».
Метод может быть использован для секвенирования целых хромосом (отсюда и название «прогулка по хромосоме»). [10] Метод «прогулки по праймеру» также стал основой для разработки метода дробовика , который использует случайные праймеры вместо специально выбранных.
{{cite web}}: |last=имеет общее название ( помощь ){{cite book}}: CS1 maint: others (link)