ПЦР с горячим стартом — это модифицированная форма обычной полимеразной цепной реакции (ПЦР), которая снижает присутствие нежелательных продуктов и димеров праймеров из-за неспецифической амплификации ДНК при комнатной (или более низкой) температуре. [1] [2] Было разработано много вариаций и модификаций процедуры ПЦР для достижения более высоких выходов; ПЦР с горячим стартом — одна из них. [3] ПЦР с горячим стартом следует тем же принципам, что и обычная ПЦР, — в том, что она использует ДНК-полимеразу для синтеза ДНК из одноцепочечной матрицы. [4] Однако она использует дополнительные методы нагревания и разделения, такие как инактивация или ингибирование связывания полимеразы Taq и позднее добавление полимеразы Taq, для увеличения выхода продукта, а также обеспечения более высокой специфичности и чувствительности. [5] Неспецифическое связывание и праймирование или образование димеров праймеров сводятся к минимуму путем завершения реакционной смеси после денатурации . [6] Некоторые способы завершения реакционных смесей при высоких температурах включают модификации, которые блокируют активность ДНК-полимеразы при низких температурах, [1] [7] использование модифицированных дезоксирибонуклеотидтрифосфатов (dNTP) [8] и физическое добавление одного из основных реагентов после денатурации. [9]
Благодаря этим дополнительным методам ПЦР с горячим стартом способна уменьшить количество неспецифических амплификации, которые естественным образом происходят при более низких температурах, что остается проблемой для обычной ПЦР. Эти модификации работают в целом, чтобы гарантировать, что специфические ферменты в растворе останутся неактивными или будут ингибированы до тех пор, пока не будет достигнута оптимальная температура отжига. [10] Ингибирование образования неспецифических продуктов ПЦР, особенно на ранних циклах, приводит к существенному повышению чувствительности амплификации с помощью ПЦР. Это имеет первостепенное значение в диагностических применениях ПЦР или ОТ-ПЦР.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — это метод молекулярной биологии, используемый для амплификации определенных сегментов ДНК на несколько порядков величины. Определенные сегменты ДНК амплифицируются в ходе трех процессов: денатурации, отжига и удлинения, — где цепи ДНК разделяются путем повышения температуры до оптимальной от комнатной температуры, прежде чем праймеры связываются, а полимераза выравнивает нуклеотиды с шаблонной цепью. Он использует ДНК-полимеразу , которая слабо активна при низких температурах. [1] В обычной ПЦР реакционная смесь завершается при комнатной температуре, и из-за активности ДНК-полимеразы праймеры могут образовывать димеры праймеров или неспецифически отжигаться с ДНК. Во время процедуры ПЦР ДНК-полимераза удлиняет любой фрагмент ДНК со связанными праймерами, генерируя целевые продукты, а также неспецифические продукты, которые снижают выход. В ПЦР с горячим стартом некоторые реагенты хранятся отдельно, пока смесь не нагреется до определенной температуры отжига. Это сокращает время отжига, что в свою очередь снижает вероятность неспецифического удлинения ДНК и влияние неспецифического связывания праймера до денатурации. [6] [5]
В обычной ПЦР более низкие температуры ниже оптимальной температуры отжига (50-65 °C) приводят к нецелевым модификациям, таким как неспецифические амплификации, где праймеры будут неспецифически связываться с нуклеиновой кислотой. [5] Эти неспецифические комплексы праймеров, которые в избытке в смеси, являются причиной синтеза побочных продуктов, таких как димер праймера и неправильное праймирование. [10] Неправильное праймирование значительно затрудняет и снижает эффективность амплификации ПЦР, активно конкурируя с целевыми последовательностями за амплификацию. Аналогичным образом, димеры праймеров образуют комплексы, которые уменьшают количество полученных амплификаций числа копий. [10] Это можно контролировать, реализуя ПЦР с горячим стартом, которая позволяет блокировать удлинение праймера до тех пор, пока не будут достигнуты оптимальные температуры. [2]
При горячем старте ПЦР важные реагенты (такие как ДНК-полимераза и кофакторы магния ) не могут реагировать в смеси ПЦР до тех пор, пока не будут достигнуты оптимальные температуры посредством физического разделения или химических модификаций. [5] [2] Горячий старт ПЦР также может происходить, когда полимераза Taq ингибируется/инактивируется или ее добавление задерживается до достижения оптимальных температур отжига, посредством модификаций дезоксирибонуклеотидтрифосфата или путем модификации праймеров посредством каркасирования и манипуляции вторичной структурой .
ПЦР с горячим стартом часто является лучшим подходом по сравнению с традиционной ПЦР в случаях, когда в реакционной смеси низкая концентрация ДНК, матрица ДНК очень сложна или если в ПЦР присутствует несколько пар олигонуклеотидных праймеров. [3]
ПЦР с горячим стартом — это метод, который предотвращает расширение ДНК-полимеразы при более низкой температуре, чтобы предотвратить неспецифическое связывание и минимизировать потерю выхода. ПЦР с горячим стартом уменьшает количество неспецифического связывания посредством ограничения реагентов до нагревания этапов ПЦР — ограничивает реакцию на ранней стадии, ограничивая Taq ДНК-полимеразу в реакции. Неспецифическое связывание часто приводит к образованию димеров праймеров и неправильно/ложно праймированных мишеней. [11] Это можно исправить с помощью модифицированных методов, таких как:
Фермент-связанные антитела/Taq ДНК-полимераза в комплексе с антителами против Taq ДНК-полимеразы:
Связанные с ферментом антитела инактивируют ДНК-полимеразу Taq. Антитела связываются и связываются с полимеразой, предотвращая раннюю амплификацию ДНК, которая может произойти при более низких температурах. Как только достигается оптимальная температура отжига, антитела начинают деградировать и диссоциировать, высвобождая ДНК-полимеразу Taq в реакцию и позволяя начать процесс амплификации. [2] [12] Platinum Taq DNA Polymerase и AccuStart Taq DNA Polymerase (обе разработаны Аюбом Рашчианом в Life Technologies и Quanta BioSciences соответственно) являются примерами коммерчески доступных антител на основе горячего старта Taq DNA Polymerase. Эти Taq DNA Polymerase предварительно скомплексированы со смесью моноклональных антител, специфичных для Taq DNA Polymerase. [13]
Восковые бусины:
Физический барьер создается между Taq ДНК-полимеразой и остальными компонентами ПЦР с помощью восковых шариков, которые зависят от температуры. Как только температура поднимается выше 70 °C, во время стадии денатурации в первом цикле, восковой шарик плавится, позволяя Taq ДНК-полимеразе вырваться через барьер и попасть в реакцию, что инициирует процесс амплификации. Затем восковой слой перемещается в верхнюю часть реакционной смеси во время стадии амплификации, чтобы позднее действовать как барьер для пара. [2]
Высокоспецифичные олигонуклеотиды:
Олигонуклеотиды — это короткие полимеры нуклеиновой кислоты, которые легко связываются. Высокоспецифичные олигонуклеотиды, такие как аптамеры, связываются с ДНК-полимеразой Taq при более низких температурах, делая ее неактивной в смеси. Только при более высоких температурах олигонуклеотиды отделяются от Taq, позволяя ей реагировать. [5]
Это наиболее эффективные методы для ПЦР с горячим стартом, в частности, методы с использованием ферментных антител и высокоспецифичных олигонуклеотидов, которые наиболее подходят для процедур, требующих более короткого времени инактивации. [14] Однако известно, что применяются и другие методы, такие как:
Предварительный нагрев:
Машина ПЦР нагревается заранее, пока компоненты смешиваются на льду, а затем немедленно помещается в машину ПЦР, как только она достигает оптимальной температуры. Это исключит необходимый процесс нагрева, уменьшит неспецифический отжиг праймеров и гарантирует, что любые пропущенные спаренные праймеры в смеси будут разделены. [15]
Замораживание:
Замораживание действует как форма физического разделения, во многом похожая на восковые шарики. Реакционная смесь, содержащая праймеры, нить матрицы, воду и дезоксирибонуклеотидтрифосфат (dNTP), замораживается перед тем, как Taq-полимераза и оставшиеся компоненты ПЦР добавляются поверх замороженной смеси. Это предотвращает неспецифическое связывание. [15]
Позднее добавление Taq:
Компоненты ПЦР в реакционной смеси готовятся и нагреваются без добавления Taq. Taq вводится в смесь только позже, когда достигается оптимальная температура. Однако этот метод является наименее надежным и может привести к загрязнению компонентов. [15]
Другой метод заключается в проведении ПЦР с горячим стартом, опосредованной дезоксирибонуклеотидтрифосфатом, которая модифицирует нуклеотидные основания с помощью защитной группы.
Горячий старт dNTP может быть химически модифицирован для включения термочувствительной защитной группы на 3-м первичном конце. Эта модификация не позволит нуклеотидам взаимодействовать с полимеразой Taq для связывания с нитью шаблона до тех пор, пока не будут достигнуты оптимальные температуры, поэтому защитная группа будет удалена во время этапа тепловой активации. Горячий старт dNTP, dA, dT, dC и dG заменяют естественные нуклеотиды. [16] [17] Рекомендуется использовать все четыре модифицированных нуклеотида, однако предыдущие исследования показывают, что замены одного или двух естественных нуклеотидов на модифицированные dNTP будет достаточно, чтобы гарантировать, что неспецифическая амплификация не произойдет. [16] [17] Другая химическая модификация нуклеиновой кислоты осуществляется посредством термообратимой ковалентной модификации, которая препятствует гибридизации праймеров с интересующим шаблоном. Аминогруппа гуанозина взаимодействует с глиоксалем, образуя dG. [18]
Вторичная структура:
Определенная вторичная структура может препятствовать функциям праймеров. Например, олигонуклеотиды со структурой шпильки не могут эффективно действовать в качестве праймера. Однако после нагревания реакционной смеси до температуры отжига праймер претерпит изменение конформации, что позволит праймеру вместо этого сформировать линейную структуру, которая позволит праймеру прикрепиться к целевому сегменту и начать ПЦР. [19] [20] На самом деле, существует более стабильная конфигурация праймеров-шпилек, называемых праймерами «двойного пузыря», которые образуют конфигурацию гомодимера голова к хвосту, которую можно использовать как для обратной транскрипции, так и для ПЦР с горячим стартом. [21]
Фотохимически удаляемые клетки:
Группа связывания, которая является защитной группой, которая фотохимически удаляется, например, связывающие тимидиновые фосфорамидиты, включена в олигонуклеотидный праймер. Это позволяет активировать и дезактивировать функцию праймера с помощью УФ-облучения (365 нм). Таким образом, праймеры могут быть активированы после достижения температуры отжига. [22]
Магний необходим в ПЦР и действует как кофактор, поскольку полимераза Taq зависит от магния. [23] Увеличение концентрации магния и фосфата в стандартных буферных реагентах создает осадок магния , обеспечивая горячий старт реакции, поскольку для ДНК-полимеразы нет магния до стадии термического циклирования. Во время термического циклирования магний растворяется обратно в растворе и становится доступным для использования полимеразой, позволяя ей нормально функционировать. [24]
ПЦР с горячим стартом выгодна тем, что требует меньше обработки и снижает риск заражения. ПЦР с горячим стартом может быть химически модифицированной или основанной на антителах, что обеспечивает различные преимущества процедуры. В химически модифицированной ПЦР с горячим стартом процедура может проводиться при комнатной температуре и значительно снижает образование димеров праймеров, предотвращая связывание праймеров друг с другом до начала процесса ПЦР, а также ограничивая неспецифическое праймирование. Аналогичным образом, ПЦР с горячим стартом ингибирует связывание праймеров с последовательностями шаблонов, которые имеют низкую гомологию, что приводит к неправильному старту. Она также может улучшить специфичность и чувствительность из-за строгих условий, а также увеличить выход продукта целевого фрагмента. [5] В ПЦР с горячим стартом на основе антител полимераза активируется после начального этапа денатурации во время процесса циклирования, тем самым сокращая требуемое время. Это также приводит к высокой специфичности . [14]
Наряду со своими преимуществами, горячий старт ПЦР также имеет ограничения, которые необходимо учитывать перед внедрением метода. Горячий старт ПЦР требует добавления тепла в течение более длительных периодов времени по сравнению с обычной ПЦР, поэтому шаблон ДНК более восприимчив к повреждению. Увеличенное время нагрева также означает, что процедура несовместима с определенными процедурами, такими как метод обратной транскрипции-ПЦР с одной пробиркой и одним буфером, который требует более низкой температуры для прохождения этапа обратной транскрипции. [12] В химически модифицированной горячей старт ПЦР процесс амплификации ДНК может быть негативно затронут, во-первых, из-за значительного увеличения времени реактивации, необходимого для активации полимеразы, и, во-вторых, если длина целевой матрицы ДНК слишком велика. [14] В процедурах на основе антител для каждого фермента требуется другое антитело, и поэтому стоимость выполнения процедуры выше. [15] Также имеются данные, что многие коммерческие горячие стартовые ферменты на самом деле имеют некоторый уровень активности до денатурации, и лишь немногие поставщики предоставляют какую-либо информацию о тестировании на эту остаточную активность. [25] Это означает, что преимущества, приписываемые ферментам горячего старта, могут не быть реализованы или, в лучшем случае, будут различаться в зависимости от партии или производителя.
