Внутренний сайт входа рибосомы , сокращенно IRES , представляет собой элемент РНК , который позволяет инициировать трансляцию независимо от кэпа, как часть более крупного процесса синтеза белка . Инициация эукариотической трансляции почти всегда происходит на 5'-кэпе молекул мРНК и зависит от него, где формируется комплекс инициации трансляции, а рибосомы взаимодействуют с мРНК. Однако элементы IRES позволяют рибосомам взаимодействовать с мРНК и начинать трансляцию независимо от 5'-кэпа.
Последовательности IRES были впервые обнаружены в 1988 году в геномах РНК вируса полиомиелита (PV) и вируса энцефаломиокардита (EMCV) в лабораториях Наума Зоненберга [1] и Эккарда Виммера [2] соответственно. Они описываются как отдельные области молекул РНК, которые способны привлекать эукариотическую рибосому к мРНК. Этот процесс также известен как кэп-независимая трансляция. Было показано, что элементы IRES имеют отчетливую вторичную или даже третичную структуру , но подобные структурные особенности на уровнях первичной или вторичной структуры, которые являются общими для всех сегментов IRES, до сих пор не были зарегистрированы.
Использование последовательностей IRES в молекулярной биологии вскоре стало обычным в качестве инструмента для экспрессии нескольких генов из одной транскрипционной единицы в генетическом векторе . В таких векторах трансляция первого цистрона инициируется на 5'-конце, а трансляция любого нижестоящего цистрона активируется элементом IRES, добавленным на его 5'-конце. [3]
Элементы IRES чаще всего встречаются в 5'-нетранслируемой области , но могут также встречаться в других местах мРНК. МРНК вирусов семейства Dicistroviridae обладают двумя открытыми рамками считывания (ORF), и трансляция каждой из них направляется отдельным IRES. Также предполагалось, что некоторые клеточные мРНК млекопитающих также имеют IRES, хотя это было предметом спора. [4] [5] Некоторые из этих клеточных элементов IRES расположены в мРНК, кодирующих белки, участвующие в выживании при стрессе и других процессах, критических для выживания. По состоянию на сентябрь 2009 года сообщалось о 60 животных и 8 растительных вирусах, содержащих элементы IRES, а также о 115 последовательностях мРНК, содержащих их. [6]
IRES часто используются вирусами как средство обеспечения активности вирусной трансляции при ингибировании трансляции хозяином. Эти механизмы ингибирования трансляции хозяином разнообразны и могут быть инициированы как вирусом, так и хозяином, в зависимости от типа вируса. Однако в случае большинства пикорнавирусов, таких как полиовирус , это достигается путем вирусного протеолитического расщепления eIF4G, так что он не может взаимодействовать с белком eIF4E, связывающим 5'-кэп . Взаимодействие между этими двумя эукариотическими факторами инициации (eIF) комплекса eIF4F необходимо для рекрутирования рибосомальной субъединицы 40S на 5'-конец мРНК, что, как полагают, происходит при образовании петли мРНК 5'-кэп к 3'- поли(А)-хвосту . Вирус может даже использовать частично расщепленный eIF4G для помощи в инициировании трансляции, опосредованной IRES.
Клетки также могут использовать IRES для увеличения трансляции определенных белков во время митоза и запрограммированной клеточной смерти . В митозе клетка дефосфорилирует eIF4E , так что он имеет малое сродство к 5'cap . В результате рибосомальная субъединица 40S и трансляционный аппарат переключаются на IRES в мРНК. Многие белки, участвующие в митозе, кодируются мРНК IRES. При запрограммированной клеточной смерти расщепление eIF-4G, например, выполняемое вирусами, снижает трансляцию. Отсутствие необходимых белков способствует гибели клетки, как и трансляция последовательностей мРНК IRES, кодирующих белки, участвующие в контроле клеточной смерти. [7]
На сегодняшний день механизм функционирования вирусного IRES изучен лучше, чем механизм функционирования клеточного IRES, [8] , который все еще является предметом дискуссий. IRES, подобные HCV, напрямую связывают рибосомальную субъединицу 40S, чтобы расположить свои инициирующие кодоны в рибосомальном P-сайте без сканирования мРНК. Эти IRES по-прежнему используют эукариотические факторы инициации (eIF) eIF2 , eIF3 , eIF5 и eIF5B , но не требуют факторов eIF1 , eIF1A и комплекса eIF4F . Напротив, IRES пикорнавирусов не связывают субъединицу 40S напрямую, а вместо этого привлекаются через сайт связывания eIF4G . [9] Многим вирусным IRES (и клеточным IRES) требуются дополнительные белки для опосредования их функции, известные как транс -действующие факторы IRES (ITAF). Роль ITAF в функционировании IRES все еще изучается.
Тестирование последовательностей на потенциальную функцию IRES обычно основывалось на использовании бицистронных репортерных анализов . В этих тестах предполагаемый сегмент IRES вводится в плазмиду между двумя цистронами, кодирующими два разных репортерных белка. Промотор выше первого цистрона управляет транскрипцией обоих цистронов в одной мРНК. Клетки трансфицируются плазмидой, и затем проводятся анализы для количественной оценки экспрессии двух репортеров в клетках. Увеличение соотношения экспрессии нижестоящего репортера относительно вышестоящего репортера принимается как доказательство активности IRES в тестовой последовательности. Однако без характеристики видов мРНК, полученных из таких плазмид, нельзя исключать другие объяснения увеличения этого соотношения. [4] [5] Например, известно несколько случаев предполагаемых элементов IRES, которые позже были зарегистрированы как имеющие функцию промотора . Неожиданная активность сплайсинга в нескольких зарегистрированных элементах IRES также, как было показано, отвечает за очевидную функцию IRES, наблюдаемую в тестах бицистронного репортера. [10] Промотор или акцептор сплайсинга в тестовой последовательности может привести к образованию моноцистронной мРНК, из которой нижестоящий цистрон транслируется посредством обычной кэп-зависимой, а не опосредованной IRES инициации. Более позднее исследование, документировавшее множество неожиданных аберрантных видов мРНК, возникающих из репортерных плазмид, показало, что сайты акцептора сплайсинга могут имитировать как элементы IRES, так и промотора в тестах, использующих такие плазмиды, что еще раз подчеркивает необходимость осторожности при интерпретации результатов анализа репортера при отсутствии тщательного анализа РНК. [11]
Последовательности IRES часто используются в молекулярной биологии для совместной экспрессии нескольких генов под контролем одного и того же промотора, тем самым имитируя полицистронную мРНК. В течение последних десятилетий последовательности IRES использовались для разработки сотен генетически модифицированных моделей животных-грызунов. [12] Преимущество этой техники в том, что улучшается молекулярная обработка. Проблема с IRES заключается в том, что экспрессия каждого последующего гена снижается. [13]
Другим вирусным элементом для установления полицистронной мРНК у эукариот являются 2А-пептиды . Здесь потенциальное снижение экспрессии генов и степень неполного разделения белков зависят от контекста. [14]