Масс-спектрометрия ( МС ) — это аналитический метод, который используется для измерения отношения массы к заряду ионов . Результаты представлены в виде масс-спектра — графика зависимости интенсивности от отношения массы к заряду. Масс-спектрометрия используется во многих различных областях и применяется как к чистым образцам, так и к сложным смесям.
Масс-спектр — это тип графика ионного сигнала как функции отношения массы к заряду. Эти спектры используются для определения элементной или изотопной подписи образца, массы частиц и молекул , а также для выяснения химической идентичности или структуры молекул и других химических соединений .
В типичной процедуре МС образец, который может быть твердым, жидким или газообразным, ионизируется , например, бомбардируя его пучком электронов . Это может привести к тому, что некоторые молекулы образца распадутся на положительно заряженные фрагменты или просто станут положительно заряженными без фрагментации. Эти ионы (фрагменты) затем разделяются в соответствии с их отношением массы к заряду, например, путем их ускорения и воздействия на них электрического или магнитного поля: ионы с одинаковым соотношением массы к заряду будут подвергаться одинаковому отклонению. . [1] Ионы обнаруживаются с помощью механизма, способного обнаруживать заряженные частицы, такого как электронный умножитель . Результаты отображаются в виде спектров интенсивности сигнала обнаруженных ионов в зависимости от отношения массы к заряду. Атомы или молекулы в образце можно идентифицировать путем сопоставления известных масс (например, целой молекулы) с идентифицированными массами или посредством характерного рисунка фрагментации .
В 1886 году Ойген Гольдштейн наблюдал лучи в газовых разрядах под низким давлением, которые шли от анода и через каналы в перфорированном катоде , противоположно направлению отрицательно заряженных катодных лучей (которые идут от катода к аноду). Гольдштейн назвал эти положительно заряженные анодные лучи «каналстрахленами»; стандартный перевод этого термина на английский язык — « канальные лучи ». Вильгельм Вин обнаружил, что сильные электрические или магнитные поля отклоняют лучи в канале, и в 1899 году сконструировал устройство с перпендикулярными электрическими и магнитными полями, которое разделяло положительные лучи в соответствии с их отношением заряда к массе ( К/м ). Вин обнаружил, что отношение заряда к массе зависит от природы газа в разрядной трубке. Английский ученый Дж. Дж. Томсон позже усовершенствовал работу Вина, уменьшив давление на создание масс-спектрографа.
Слово « спектрограф » стало частью международного научного словаря к 1884 году . _ фотографическая пластинка . [4] [5] Масс -спектроскоп похож на масс-спектрограф , за исключением того, что луч ионов направляется на люминофорный экран. [6] Конфигурация масс-спектроскопа использовалась в первых приборах, когда хотелось быстро наблюдать эффекты регулировок. После правильной настройки инструмента вставляли и экспонировали фотографическую пластинку. Термин масс-спектроскоп продолжал использоваться даже несмотря на то, что прямое освещение люминофорного экрана было заменено косвенными измерениями с помощью осциллографа . [7] Использование термина масс-спектроскопия в настоящее время не рекомендуется из-за возможности путаницы со световой спектроскопией . [1] [8] Масс-спектрометрию часто называют масс-спектрометрией или просто МС . [1]
Современные методы масс-спектрометрии были разработаны Артуром Джеффри Демпстером и Ф. У. Астоном в 1918 и 1919 годах соответственно.
Секторные масс-спектрометры , известные как калютроны , были разработаны Эрнестом О. Лоуренсом и использовались для разделения изотопов урана во время Манхэттенского проекта . [9] Масс-спектрометры Calutron использовались для обогащения урана на заводе Y-12 в Ок-Ридже, штат Теннесси, созданном во время Второй мировой войны.
В 1989 году половина Нобелевской премии по физике была присуждена Гансу Демельту и Вольфгангу Паулю за разработку метода ионной ловушки в 1950-х и 1960-х годах.
В 2002 году Нобелевская премия по химии была присуждена Джону Беннетту Фенну за разработку метода ионизации электрораспылением (ESI) и Коичи Танаке за разработку метода мягкой лазерной десорбции (SLD) и его применения для ионизации биологических макромолекул, особенно белков. [10]
Масс-спектрометр состоит из трех компонентов: источника ионов, масс-анализатора и детектора. Ионизатор преобразует часть образца в ионы . Существует большое разнообразие методов ионизации, в зависимости от фазы (твердая, жидкая, газообразная) образца и эффективности различных механизмов ионизации неизвестных частиц. Система экстракции удаляет ионы из образца, которые затем направляются через масс-анализатор в детектор . Различия в массах фрагментов позволяют масс-анализатору сортировать ионы по соотношению массы к заряду. Детектор измеряет значение индикаторной величины и, таким образом, предоставляет данные для расчета содержания каждого присутствующего иона. Некоторые детекторы также дают пространственную информацию, например, многоканальная пластинка.
Ниже описана работа спектрометра-масс-анализатора секторного типа . (Другие типы анализаторов рассматриваются ниже.) Рассмотрим образец хлорида натрия (поваренной соли). В источнике ионов образец испаряется (превращается в газ ) и ионизируется (превращается в электрически заряженные частицы) в ионы натрия (Na + ) и хлорида (Cl - ). Атомы и ионы натрия моноизотопны , их масса составляет около 23 дальтон (символ: Da или более старый символ: u). Атомы и ионы хлоридов представлены двумя стабильными изотопами с массами примерно 35 ед. (при естественной распространенности около 75 процентов) и примерно 37 ед. (при естественной распространенности около 25 процентов). Анализаторная часть спектрометра содержит электрические и магнитные поля, которые оказывают воздействие на ионы, проходящие через эти поля. Скорость заряженной частицы может увеличиваться или уменьшаться при прохождении через электрическое поле, а ее направление может изменяться под действием магнитного поля. Величина отклонения траектории движущегося иона зависит от отношения его массы к заряду. Более легкие ионы отклоняются магнитной силой в большей степени, чем более тяжелые ионы (на основе второго закона движения Ньютона , F = ma ). Потоки магнитно-сортированных ионов проходят от анализатора к детектору, который фиксирует относительное содержание каждого типа ионов. Эта информация используется для определения химического элементного состава исходной пробы (т.е. присутствия в пробе как натрия, так и хлора) и изотопного состава ее компонентов (соотношение 35 Cl к 37 Cl).
Источник ионов — это часть масс-спектрометра, которая ионизирует анализируемый материал (аналит). Затем ионы переносятся магнитными или электрическими полями в масс-анализатор.
Методы ионизации сыграли ключевую роль в определении типов образцов, которые можно анализировать с помощью масс-спектрометрии. Электронная ионизация и химическая ионизация применяются для газов и паров . В источниках химической ионизации аналит ионизируется в результате химических ионно-молекулярных реакций во время столкновений в источнике. Два метода, часто используемые с жидкими и твердыми биологическими образцами, включают ионизацию электрораспылением (изобретенную Джоном Фенном [11] ) и матричную лазерную десорбцию/ионизацию (MALDI, первоначально разработанную как аналогичный метод «Мягкая лазерная десорбция (SLD)» К. Танака [12] , за что была присуждена Нобелевская премия, и как MALDI М. Караса и Ф. Хилленкампа [13] ).
В масс-спектрометрии под ионизацией понимают образование ионов газовой фазы, пригодных для разрешения в масс-анализаторе или масс-фильтре. Ионизация происходит в источнике ионов . Доступно несколько источников ионов ; каждый из них имеет преимущества и недостатки для конкретных приложений. Например, электронная ионизация (ЭИ) дает высокую степень фрагментации, давая очень подробные масс-спектры, которые при умелом анализе могут предоставить важную информацию для структурного выяснения/характеризации и облегчить идентификацию неизвестных соединений по сравнению с библиотеками масс-спектров, полученными в идентичных рабочих условиях. . Однако ЭУ не подходит для сочетания с ВЭЖХ , т.е. ЖХ-МС , поскольку при атмосферном давлении нити, используемые для генерации электронов, быстро выгорают. Таким образом, ЭУ преимущественно сочетается с ГХ , т.е. ГХ-МС , где вся система находится под высоким вакуумом.
Методы жесткой ионизации — это процессы, которые передают большое количество остаточной энергии молекуле, вызывая большую степень фрагментации (т.е. систематический разрыв связей удаляет избыточную энергию, восстанавливая стабильность образующегося иона). Образующиеся ионы имеют тенденцию иметь m/z ниже, чем молекулярный ион (кроме случая переноса протона и не включая пики изотопов). Наиболее распространенным примером жесткой ионизации является электронная ионизация (ЭИ).
Мягкая ионизация относится к процессам, которые передают небольшую остаточную энергию молекуле и, как следствие, приводят к незначительной фрагментации. Примеры включают бомбардировку быстрыми атомами (FAB), химическую ионизацию (CI), химическую ионизацию при атмосферном давлении (APCI), фотоионизацию при атмосферном давлении (APPI), ионизацию электрораспылением (ESI), десорбционную ионизацию электрораспылением (DESI) и матричный лазер. десорбция/ионизация (МАЛДИ).
Источники индуктивно-связанной плазмы (ИСП) используются в основном для катионного анализа широкого спектра типов проб. В этом источнике плазма, которая в целом электрически нейтральна, но значительная часть атомов которой ионизирована при высокой температуре, используется для распыления введенных молекул образца и дальнейшего отрыва внешних электронов от этих атомов. Плазма обычно генерируется из газообразного аргона, поскольку первая энергия ионизации атомов аргона выше, чем первая у любых других элементов, кроме He, F и Ne, но ниже второй энергии ионизации всех, кроме наиболее электроположительных металлов. Нагрев достигается за счет пропускания радиочастотного тока через катушку, окружающую плазму.
Фотоионизация может использоваться в экспериментах, которые стремятся использовать масс-спектрометрию как средство выяснения механизмов химической кинетики и разветвления изомерных продуктов. [14] В таких случаях фотон высокой энергии, рентгеновский или ультрафиолетовый, используется для диссоциации стабильных газообразных молекул в газе-носителе He или Ar. В тех случаях, когда используется источник синхротронного света, можно использовать настраиваемую энергию фотонов для получения кривой эффективности фотоионизации, которую можно использовать в сочетании с отношением зарядов m/z к молекулярным и ионным частицам отпечатков пальцев. Совсем недавно была разработана фотоионизация при атмосферном давлении (APPI) для ионизации молекул, главным образом, в виде отходов систем ЖХ-МС.
Некоторые применения ионизации окружающей среды включают в себя экологические, а также клинические применения. В этих методах ионы образуются в источнике ионов вне масс-спектрометра. Отбор проб становится простым, поскольку образцы не требуют предварительного разделения или подготовки. Некоторыми примерами методов ионизации окружающей среды являются прямой анализ в реальном времени (DART), DESI , SESI , LAESI , десорбционная химическая ионизация при атмосферном давлении (DAPCI) и десорбция, фотоионизация при атмосферном давлении DAPPI и другие.
Другие включают тлеющий разряд , полевая десорбция (FD), бомбардировка быстрыми атомами (FAB), термоспрей , десорбция/ионизация на кремнии (DIOS), химическая ионизация при атмосферном давлении (APCI), масс-спектрометрия вторичных ионов (SIMS), искровая ионизация и термическая ионизация. (ТИМС). [15]
Масс-анализаторы разделяют ионы в соответствии с их отношением массы к заряду . Следующие два закона управляют динамикой заряженных частиц в электрическом и магнитном полях в вакууме:
Здесь F — сила, приложенная к иону, m — масса иона, a — ускорение, Q — заряд иона, E — электрическое поле, а v × B — векторное векторное произведение скорости иона и магнитное поле
Приравнивая приведенные выше выражения для силы, действующей на ион, получаем:
Это дифференциальное уравнение является классическим уравнением движения заряженных частиц . Вместе с начальными условиями частицы он полностью определяет движение частицы в пространстве и времени в терминах m/Q . Таким образом, масс-спектрометры можно рассматривать как «спектрометры масс-заряда». При представлении данных принято использовать (официально) безразмерное значение m/z , где z — количество элементарных зарядов ( e ) на ионе (z=Q/e). Эта величина, хотя неофициально и называется отношением массы к заряду, точнее говоря, представляет собой отношение массового числа и числа заряда z .
Существует много типов масс-анализаторов, использующих статические или динамические поля, а также магнитные или электрические поля, но все они работают в соответствии с приведенным выше дифференциальным уравнением. Каждый тип анализатора имеет свои сильные и слабые стороны. Многие масс-спектрометры используют два или более масс-анализаторов для тандемной масс-спектрометрии (МС/МС) . Помимо наиболее распространенных масс-анализаторов, перечисленных ниже, существуют и другие, предназначенные для особых ситуаций.
Существует несколько важных характеристик анализатора. Разрешающая способность по массе является мерой способности различать два пика со слегка отличающимися m/z . Точность измерения массы представляет собой отношение ошибки измерения m/z к истинному m/z. Точность измерения массы обычно измеряется в единицах массы ppm или милли . Диапазон масс представляет собой диапазон m/z, поддающийся анализу данным анализатором. Линейный динамический диапазон — это диапазон, в котором ионный сигнал линейно зависит от концентрации аналита. Скорость относится к временным рамкам эксперимента и в конечном итоге используется для определения количества спектров, которые могут быть созданы в единицу времени.
Масс-анализатор с секторным полем использует статическое электрическое и/или магнитное поле, чтобы каким-либо образом повлиять на путь и/или скорость заряженных частиц. Как показано выше, секторные инструменты искривляют траектории ионов, проходящих через масс-анализатор, в соответствии с их отношением массы к заряду, сильнее отклоняя более заряженные и более быстродвижущиеся и более легкие ионы. Анализатор можно использовать для выбора узкого диапазона m/z или для сканирования диапазона m/z для каталогизации присутствующих ионов. [16]
Анализатор времени пролета (TOF) использует электрическое поле для ускорения ионов до достижения того же потенциала , а затем измеряет время, необходимое им для достижения детектора. Если все частицы имеют одинаковый заряд , их кинетические энергии будут одинаковыми, а их скорости будут зависеть только от их массы . Ионы с меньшей массой первыми достигнут детектора. [17] Однако в действительности даже частицы с одинаковыми m/z могут прибыть к детектору в разное время, поскольку они имеют разные начальные скорости. Начальная скорость часто не зависит от массы иона и превращается в разность конечной скорости. Из-за этого ионы с одинаковым соотношением m/z будут достигать детектора в разное время, что уширяет пики, показанные на графике зависимости количества от m/z, но обычно не меняет центральное расположение пиков, поскольку Начальная скорость ионов обычно равна нулю. Чтобы решить эту проблему, фокусировка/ отложенное извлечение с задержкой по времени были объединены с TOF-MS. [18]
Квадрупольные масс-анализаторы используют осциллирующие электрические поля для избирательной стабилизации или дестабилизации путей ионов, проходящих через радиочастотное (РЧ) квадрупольное поле, создаваемое между четырьмя параллельными стержнями. Через систему в любой момент времени проходят только ионы с определенным соотношением массы/заряда, но изменения потенциалов на стержнях позволяют быстро перемещаться в широком диапазоне значений m/z, либо непрерывно, либо последовательно. дискретные прыжки. Квадрупольный масс-анализатор действует как масс-селективный фильтр и тесно связан с квадрупольной ионной ловушкой , особенно с линейной квадрупольной ионной ловушкой, за исключением того, что он предназначен для пропускания незахваченных ионов, а не для сбора захваченных ионов, и по этой причине его называют в качестве трансмиссионного четырехполюсника. Квадрупольный масс-анализатор с магнитным усилением включает добавление магнитного поля, приложенного либо в осевом, либо в поперечном направлении. Этот новый тип прибора приводит к дополнительному повышению производительности с точки зрения разрешения и/или чувствительности в зависимости от величины и ориентации приложенного магнитного поля. [19] [20] Распространенной вариацией трансмиссионного квадруполя является тройной квадрупольный масс-спектрометр. «Тройной квад» имеет три последовательные квадрупольные ступени, первая из которых действует как массовый фильтр для передачи определенного поступающего иона во второй квадруполь, камеру столкновений, в которой этот ион может быть разбит на фрагменты. Третий квадруполь также действует как массовый фильтр для передачи определенного фрагмента иона в детектор. Если квадруполь заставить быстро и многократно циклически проходить через диапазон настроек массового фильтра, можно получить полные спектры. Аналогично, тройной четверной может быть создан для выполнения различных типов сканирования, характерных для тандемной масс-спектрометрии .
Квадрупольная ионная ловушка работает по тем же физическим принципам, что и квадрупольный масс-анализатор, но ионы улавливаются и последовательно выбрасываются. Ионы улавливаются главным образом в квадрупольном радиочастотном поле, в пространстве, определяемом кольцевым электродом (обычно подключенным к основному радиочастотному потенциалу) между двумя торцевыми электродами (обычно подключенными к постоянному или вспомогательному переменному потенциалу). Образец ионизируется либо изнутри (например, электронным или лазерным лучом), либо снаружи, и в этом случае ионы часто вводятся через отверстие в торцевом электроде.
Существует множество методов разделения и изоляции массы/заряда, но наиболее часто используется режим нестабильности массы, в котором радиочастотный потенциал увеличивается так, что орбита ионов с массой a > b становится стабильной, в то время как ионы с массой b становятся нестабильными и становятся нестабильными. выбрасывается по оси z на детектор. Существуют также неразрушающие методы анализа.
Ионы также могут быть выброшены методом резонансного возбуждения, при котором к торцевым электродам прикладывается дополнительное колебательное напряжение возбуждения, а амплитуда захватывающего напряжения и/или частота напряжения возбуждения варьируется для приведения ионов в резонансное состояние в порядке их массы/ коэффициент заряда. [21] [22]
Масс -спектрометр с цилиндрической ионной ловушкой (CIT) представляет собой производную от квадрупольной ионной ловушки, в которой электроды образованы из плоских колец, а не из электродов гиперболической формы. Архитектура хорошо поддается миниатюризации, поскольку по мере уменьшения размера ловушки форма электрического поля вблизи центра ловушки, области, в которой захватываются ионы, принимает форму, аналогичную форме гиперболической ловушки.
Линейная квадрупольная ионная ловушка аналогична квадрупольной ионной ловушке, но она улавливает ионы в двумерном квадрупольном поле, а не в трехмерном квадрупольном поле, как в трехмерной квадрупольной ионной ловушке. LTQ компании Thermo Fisher («квадруполь с линейной ловушкой») является примером линейной ионной ловушки. [23]
Тороидальную ионную ловушку можно представить как линейный квадруполь, изогнутый вокруг и соединенный на концах, или как поперечное сечение трехмерной ионной ловушки, повернутой на краю, чтобы сформировать тороидальную ловушку в форме пончика. Ловушка может хранить большие объемы ионов, распределяя их по кольцеобразной структуре ловушки. Эта ловушка тороидальной формы представляет собой конфигурацию, которая позволяет увеличить миниатюризацию масс-анализатора с ионной ловушкой. Кроме того, все ионы сохраняются в одном и том же поле захвата и выбрасываются вместе, что упрощает обнаружение, которое может быть осложнено конфигурациями матриц из-за различий в выравнивании детекторов и механической обработке матриц. [24]
Как и в случае с тороидальной ловушкой, линейные ловушки и 3D-квадрупольные ионные ловушки являются наиболее часто миниатюрными масс-анализаторами из-за их высокой чувствительности, устойчивости к давлению мТорр и возможностей тандемной масс-спектрометрии с одним анализатором (например, сканирования дочерних ионов). [25]
Приборы с орбитальной ловушкой аналогичны масс-спектрометрам ионного циклотронного резонанса с Фурье-преобразованием (см. текст ниже). Ионы электростатически захватываются на орбите вокруг центрального электрода веретенообразной формы. Электрод удерживает ионы так, что они вращаются вокруг центрального электрода и колеблются вперед и назад вдоль длинной оси центрального электрода. Это колебание генерирует ток изображения в пластинах детектора, который регистрируется прибором. Частоты этих токов изображения зависят от отношения массы к заряду ионов. Масс-спектры получены путем преобразования Фурье токов записанного изображения.
Орбитальные ловушки обладают высокой точностью определения массы, высокой чувствительностью и хорошим динамическим диапазоном. [26]
Масс-спектрометрия с преобразованием Фурье (FTMS), или, точнее, МС ионного циклотронного резонанса с преобразованием Фурье , измеряет массу путем обнаружения тока изображения, создаваемого циклотронным движением ионов в присутствии магнитного поля. Вместо измерения отклонения ионов с помощью такого детектора, как электронный умножитель , ионы вводятся в ловушку Пеннинга (статическую электрическую/магнитную ионную ловушку ), где они эффективно образуют часть цепи. Детекторы, расположенные в фиксированных положениях в пространстве, измеряют электрический сигнал ионов, которые проходят рядом с ними с течением времени, создавая периодический сигнал. Поскольку частота циклического движения иона определяется отношением его массы к заряду, ее можно выполнить деконволюцию , выполнив преобразование Фурье сигнала. Преимущество FTMS заключается в высокой чувствительности (поскольку каждый ион «подсчитывается» более одного раза) и гораздо более высоком разрешении и, следовательно, точности. [27] [28]
Ионный циклотронный резонанс (ИКР) — это более старый метод масс-анализа, аналогичный FTMS, за исключением того, что ионы обнаруживаются с помощью традиционного детектора. Ионы, попавшие в ловушку Пеннинга, возбуждаются радиочастотным электрическим полем до тех пор, пока не ударятся о стенку ловушки, где расположен детектор. Ионы различной массы разделяются в зависимости от времени воздействия.
Последним элементом масс-спектрометра является детектор. Детектор регистрирует либо индуцированный заряд, либо ток, возникающий, когда ион проходит мимо поверхности или ударяется о нее. В сканирующем приборе сигнал, создаваемый детектором во время сканирования, в зависимости от того, где находится прибор при сканировании (при каком значении m/Q ), будет формировать масс-спектр , запись ионов в зависимости от m/Q .
Обычно используется тот или иной тип электронного умножителя , хотя также используются и другие детекторы, включая чашки Фарадея и детекторы ионов-фотонов . Поскольку количество ионов, покидающих масс-анализатор в конкретный момент, обычно весьма мало, для получения сигнала часто требуется значительное усиление. Микроканальные пластинчатые детекторы обычно используются в современных коммерческих приборах. [29] В FTMS и Orbitraps детектор состоит из пары металлических поверхностей в области масс-анализатора/ионной ловушки, мимо которых ионы проходят только во время колебаний. Постоянный ток не образуется, в цепи между электродами создается только слабый переменный ток изображения. Также использовались другие индуктивные детекторы. [30]
Тандемный масс-спектрометр — это прибор, способный выполнять несколько циклов масс-спектрометрии, обычно разделенных той или иной формой фрагментации молекул. Например, один масс-анализатор может выделить один пептид из многих, поступающих в масс-спектрометр. Затем второй масс-анализатор стабилизирует ионы пептидов во время их столкновения с газом, вызывая их фрагментацию за счет диссоциации, вызванной столкновением (CID). Затем третий масс-анализатор сортирует фрагменты, полученные из пептидов. Тандемную МС также можно проводить в одном масс-анализаторе с течением времени, например, в квадрупольной ионной ловушке . Существуют различные методы фрагментации молекул для тандемного МС, включая диссоциацию, индуцированную столкновениями (CID), диссоциацию с электронным захватом (ECD), диссоциацию с переносом электрона (ETD), инфракрасную многофотонную диссоциацию (IRMPD), инфракрасную радиационную диссоциацию черного тела (BIRD), электронную -отрывная диссоциация (EDD) и поверхностно-индуцированная диссоциация (SID). Важным применением тандемной масс-спектрометрии является идентификация белков. [31]
Тандемная масс-спектрометрия позволяет проводить различные экспериментальные последовательности. Многие коммерческие масс-спектрометры предназначены для ускорения выполнения таких рутинных последовательностей, как мониторинг выбранных реакций (SRM) и сканирование ионов-предшественников. В SRM первый анализатор пропускает только одну массу, а второй анализатор отслеживает несколько определяемых пользователем фрагментарных ионов. SRM чаще всего используется со сканирующими приборами, где второе событие массового анализа ограничено рабочим циклом . Эти эксперименты используются для повышения специфичности обнаружения известных молекул, особенно в фармакокинетических исследованиях. Сканирование ионов-предшественников относится к мониторингу конкретных потерь иона-предшественника. Первый и второй масс-анализаторы сканируют спектр, разделенный по заданному пользователем значению m/z . Этот эксперимент используется для обнаружения специфических мотивов внутри неизвестных молекул.
Другой тип тандемной масс-спектрометрии, используемый для радиоуглеродного датирования, - это масс-спектрометрия с ускорителем (AMS), в которой используются очень высокие напряжения, обычно в мегавольтном диапазоне, для ускорения отрицательных ионов в своего рода тандемный масс-спектрометр.
База данных метаболитов и химических веществ METLIN [32] [33] [34] является крупнейшим хранилищем данных экспериментальной тандемной масс-спектрометрии, полученных из стандартов. Данные тандемной масс-спектрометрии по более чем 850 000 молекулярным стандартам (по состоянию на 24 августа 2020 г.) [32] предоставлены для облегчения идентификации химических веществ в экспериментах по тандемной масс-спектрометрии. Помимо идентификации известных молекул, он также полезен для идентификации неизвестных с использованием поиска/анализа сходства. [35] Все данные тандемной масс-спектрометрии получены в результате экспериментального анализа стандартов при нескольких энергиях столкновения и в режимах как положительной, так и отрицательной ионизации. [32]
Когда на практике становится общепринятой конкретная комбинация источника, анализатора и детектора, для ее краткого обозначения может возникнуть составная аббревиатура . Одним из примеров является MALDI-TOF , который относится к комбинации матричного источника лазерной десорбции/ионизации с времяпролетным масс-анализатором. Другие примеры включают масс-спектрометрию с индуктивно связанной плазмой (ICP-MS) , масс-спектрометрию с ускорителем (AMS) , масс-спектрометрию с термической ионизацией (TIMS) и масс-спектрометрию с искровым источником (SSMS) .
В некоторых приложениях масс-спектрометрии появились названия, которые, хотя, строго говоря, кажутся относящимися к широкому применению, на практике вместо этого стали обозначать конкретную или ограниченное количество конфигураций приборов. Примером этого является масс-спектрометрия изотопного отношения (IRMS), которая на практике означает использование ограниченного числа секторных масс-анализаторов; это имя используется для обозначения как приложения, так и инструмента, используемого для приложения.
Важным улучшением возможностей масс-спектрометрии по разрешению и определению массы является ее использование в тандеме с хроматографическими и другими методами разделения.
Распространенной комбинацией является газовая хроматография-масс-спектрометрия (ГХ/МС или ГХ-МС). В этом методе газовый хроматограф используется для разделения различных соединений. Этот поток разделенных соединений подается в источник ионов — металлическую нить накала , к которой подается напряжение . Эта нить испускает электроны, которые ионизируют соединения. Затем ионы могут фрагментироваться дальше, создавая предсказуемые закономерности. Неповрежденные ионы и фрагменты попадают в анализатор масс-спектрометра и в конечном итоге детектируются. [36] Однако высокие температуры (300°C), используемые в инжекционном порте ГХ-МС (и в печи), могут привести к термическому разложению введенных молекул, что приводит к измерению продуктов разложения вместо фактической молекулы(ов). представляет интерес. [37]
Подобно газовой хроматографии-МС (ГХ-МС), жидкостная хроматография-масс-спектрометрия (ЖХ/МС или ЖХ-МС) разделяет соединения хроматографически перед их введением в источник ионов и масс-спектрометр. Он отличается от ГХ-МС тем, что подвижной фазой является жидкость, обычно смесь воды и органических растворителей , а не газа. Чаще всего в ЖХ-МС используется источник ионизации электрораспылением . Другими популярными и коммерчески доступными источниками ионов для ЖХ-МС являются химическая ионизация при атмосферном давлении и фотоионизация при атмосферном давлении . Есть также некоторые недавно разработанные методы ионизации, такие как лазерное распыление .
Капиллярный электрофорез-масс-спектрометрия (КЭ-МС) — это метод, который сочетает в себе процесс разделения жидкостей капиллярного электрофореза с масс-спектрометрией. [38] CE-MS обычно сочетается с ионизацией электрораспылением. [39]
Спектрометрия ионной подвижности-масс-спектрометрия (IMS/MS или IMMS) — это метод, при котором ионы сначала разделяются за счет времени дрейфа через нейтральный газ под приложенным градиентом электрического потенциала перед введением в масс-спектрометр. [40] Время дрейфа является мерой радиуса относительно заряда иона. Рабочий цикл IMS (время, в течение которого проводится эксперимент) длиннее, чем у большинства масс-спектрометрических методов, так что масс-спектрометр может отбирать пробы в ходе разделения IMS. Это дает данные о разделении IMS и отношении массы к заряду ионов аналогично ЖХ-МС . [41]
Рабочий цикл IMS короче по сравнению с разделением жидкостной хроматографией или газовой хроматографией, и поэтому его можно сочетать с такими методами, создавая тройные методы, такие как ЖХ/IMS/МС. [42]
Масс-спектрометрия дает различные типы данных. Наиболее распространенным представлением данных является масс-спектр .
Определенные типы данных масс-спектрометрии лучше всего представить в виде масс-хроматограммы . Типы хроматограмм включают мониторинг выбранных ионов (SIM), общий ионный ток (TIC) и мониторинг выбранных реакций (SRM) и многие другие.
Другие типы данных масс-спектрометрии хорошо представлены в виде трехмерной контурной карты . В этой форме масса к заряду m/z откладывается по оси x , интенсивность — по оси y , а дополнительный экспериментальный параметр, такой как время, записывается по оси z .
Анализ данных масс-спектрометрии зависит от типа эксперимента, в котором получены данные. Общее подразделение данных имеет основополагающее значение для понимания любых данных.
Многие масс-спектрометры работают либо в режиме отрицательных ионов , либо в режиме положительных ионов . Очень важно знать, заряжены ли наблюдаемые ионы отрицательно или положительно. Это часто важно для определения нейтральной массы, но также указывает на природу молекул.
Различные типы источников ионов приводят к получению разных массивов фрагментов из исходных молекул. Источник электронной ионизации производит множество фрагментов и в основном однозарядные (1-) радикалы (нечетное число электронов), тогда как источник электрораспыления обычно производит нерадикальные квазимолекулярные ионы, которые часто имеют многократный заряд. Тандемная масс-спектрометрия намеренно производит фрагментированные ионы после источника и может радикально изменить тип данных, получаемых в ходе эксперимента.
Знание происхождения образца может дать представление о составляющих молекул образца и их фрагментации. Образец, полученный в процессе синтеза/производства, вероятно, будет содержать примеси, химически связанные с целевым компонентом. Грубо приготовленный биологический образец, вероятно, будет содержать определенное количество соли, которая в некоторых анализах может образовывать аддукты с молекулами аналита.
Результаты также могут сильно зависеть от подготовки пробы и того, как она была проведена/введена. Важным примером является вопрос о том, какая матрица используется для нанесения MALDI, поскольку большая часть энергетики процесса десорбции/ионизации контролируется матрицей, а не мощностью лазера. Иногда в образцы добавляют натрий или другие вещества, переносящие ионы, для получения аддуктов, а не протонированных частиц.
Масс-спектрометрия позволяет измерять молярную массу, молекулярную структуру и чистоту образца. Каждый из этих вопросов требует отдельной экспериментальной процедуры; следовательно, адекватное определение цели эксперимента является предпосылкой для сбора правильных данных и их успешной интерпретации.
Поскольку точная структура или пептидная последовательность молекулы расшифровывается с помощью набора масс фрагментов, интерпретация масс-спектров требует совместного использования различных методов. Обычно первой стратегией идентификации неизвестного соединения является сравнение его экспериментального масс-спектра с библиотекой масс-спектров. Если в результате поиска совпадений не получено, необходимо выполнить интерпретацию масс-спектров вручную [43] или с помощью программного обеспечения. Компьютерное моделирование процессов ионизации и фрагментации, происходящих в масс-спектрометре, является основным инструментом для определения структуры или последовательности пептида молекулы. Априорная структурная информация фрагментируется in silico , и полученная картина сравнивается с наблюдаемым спектром. Такое моделирование часто поддерживается библиотекой фрагментации [44] , которая содержит опубликованные шаблоны известных реакций разложения. Программное обеспечение , использующее эту идею, было разработано как для малых молекул, так и для белков .
Анализ масс-спектров также может проводиться по спектрам с точной массой . Значение отношения массы к заряду ( m/z ) только с целочисленной точностью может представлять огромное количество теоретически возможных ионных структур; однако более точные значения массы значительно уменьшают количество потенциальных молекулярных формул . Компьютерный алгоритм, называемый генератором формул, вычисляет все молекулярные формулы, которые теоретически соответствуют заданной массе с заданным допуском.
Недавний метод выяснения структуры в масс-спектрометрии, называемый дактилоскопией ионов-предшественников, идентифицирует отдельные фрагменты структурной информации путем проведения поиска тандемных спектров исследуемой молекулы по библиотеке спектров дочерних ионов структурно охарактеризованных ионов-предшественников. [45]
Масс-спектрометрия имеет как качественное , так и количественное применение. К ним относятся идентификация неизвестных соединений, определение изотопного состава элементов в молекуле и определение структуры соединения путем наблюдения за его фрагментацией. Другие области применения включают количественную оценку количества соединения в образце или изучение основ ионной химии газовой фазы (химии ионов и нейтральных веществ в вакууме). МС в настоящее время широко используется в аналитических лабораториях, изучающих физические, химические или биологические свойства самых разных соединений. Количественное определение может быть относительным (анализируется по отношению к эталонному образцу) или абсолютным (анализируется с использованием метода стандартной кривой). [46] [47]
Как аналитический метод он обладает явными преимуществами, такими как: Повышенная чувствительность по сравнению с большинством других аналитических методов, поскольку анализатор, как фильтр массового заряда, уменьшает фоновые помехи. Отличная специфичность благодаря характерным картинам фрагментации для идентификации неизвестных или подтверждения присутствия подозреваемых соединений. Информация о молекулярной массе. Информация об изотопном содержании элементов. Химические данные с временным разрешением.
Некоторыми недостатками метода является то, что он часто не позволяет различить оптические и геометрические изомеры, а также положения заместителей в о-, м- и р-положениях ароматического кольца. Кроме того, его возможности ограничены при идентификации углеводородов, которые производят аналогичные фрагментированные ионы.
Масс-спектрометрия также используется для определения изотопного состава элементов в образце. Различия в массе изотопов элемента очень малы, а менее распространенные изотопы элемента обычно очень редки, поэтому требуется очень чувствительный прибор. Эти инструменты, иногда называемые масс-спектрометрами изотопного соотношения (ИК-МС), обычно используют один магнит для отклонения пучка ионизированных частиц к ряду чашек Фарадея , которые преобразуют удары частиц в электрический ток . Быстрый онлайн-анализ содержания дейтерия в воде можно выполнить с помощью проточной масс-спектрометрии послесвечения , FA-MS. Вероятно, наиболее чувствительным и точным масс-спектрометром для этой цели является ускорительный масс-спектрометр (АМС). Это связано с тем, что он обеспечивает максимальную чувствительность, позволяя измерять отдельные атомы и нуклиды с динамическим диапазоном ~ 10 15 относительно основного стабильного изотопа. [48] Соотношения изотопов являются важными маркерами различных процессов. Некоторые соотношения изотопов используются для определения возраста материалов, например, при радиоуглеродном датировании . Мечение стабильными изотопами также используется для количественного определения белка. (см. характеристику белка ниже)
Масс-спектрометрия с мембранным введением сочетает соотношение изотопов MS с реакционной камерой/ячейкой, разделенной газопроницаемой мембраной. Этот метод позволяет изучать газы по мере их эволюции в растворе. Этот метод широко использовался для изучения производства кислорода Фотосистемой II . [49]
В нескольких методах используются ионы, создаваемые в специальном источнике ионов, вводимые в расходомерную трубку или дрейфовую трубку: проточная трубка с выбранными ионами (SIFT-MS) и реакция переноса протона (PTR-MS) являются вариантами химической ионизации , предназначенными для анализа газовых примесей . воздуха, дыхания или свободного пространства жидкости с использованием четко определенного времени реакции, что позволяет рассчитывать концентрации аналитов на основе известной кинетики реакции без необходимости использования внутреннего стандарта или калибровки.
Еще одним методом, применимым в области анализа газовых примесей, является вторичная ионизация электрораспылением (SESI-MS), которая является вариантом ионизации электрораспылением . SESI состоит из шлейфа электрораспыления чистого подкисленного растворителя, который взаимодействует с нейтральными парами. Молекулы пара ионизируются при атмосферном давлении, когда заряд передается от ионов, образующихся при электрораспылении, к молекулам. Одним из преимуществ этого подхода является то, что он совместим с большинством систем ESI-MS. [50] [51]
Анализатор остаточных газов (RGA) — это небольшой и обычно прочный масс-спектрометр , обычно предназначенный для управления технологическими процессами и мониторинга загрязнений в вакуумных системах . При построении квадрупольного масс-анализатора существует две реализации: либо открытый источник ионов (OIS), либо закрытый источник ионов (CIS). RGA можно найти в приложениях с высоким вакуумом , таких как исследовательские камеры, установки для изучения поверхности , ускорители , сканирующие микроскопы и т. д. RGA используются в большинстве случаев для контроля качества вакуума и легкого обнаружения мельчайших следов примесей в газе низкого давления. среда. Эти примеси можно измерять вплоть до уровней Торра , обеспечивая обнаружение на уровне менее ppm при отсутствии фоновых помех.
RGA также будут использоваться в качестве чувствительных детекторов утечек на месте , обычно с использованием гелия , изопропилового спирта или других индикаторных молекул. При откачке вакуумных систем до уровня ниже Торра (проверка целостности вакуумных уплотнений и качества вакуума) утечки воздуха, виртуальные утечки и другие загрязнения на низких уровнях могут быть обнаружены до начала процесса.Атомный зонд — это инструмент, который сочетает в себе времяпролетную масс-спектрометрию и полево-испарительную микроскопию для картирования местоположения отдельных атомов.
Фармакокинетику часто изучают с помощью масс-спектрометрии из-за сложной природы матрицы (часто крови или мочи) и необходимости высокой чувствительности для наблюдения за данными о низких дозах и длительных временных точках. Наиболее распространенным прибором, используемым в этом приложении, является ЖХ-МС с тройным квадрупольным масс-спектрометром . Для большей специфичности обычно используется тандемная масс-спектрометрия. Стандартные кривые и внутренние стандарты обычно используются для количественного определения одного фармацевтического препарата в образцах. Образцы представляют разные моменты времени, когда фармацевтический препарат вводится, а затем метаболизируется или выводится из организма. Пустые образцы или пробы с t=0, взятые перед введением, важны для определения фона и обеспечения целостности данных при таких сложных матрицах образцов. Большое внимание уделяется линейности стандартной кривой; однако нередко используется аппроксимация кривой более сложными функциями, такими как квадратичные, поскольку отклик большинства масс-спектрометров менее чем линейный в больших диапазонах концентраций. [52] [53] [54]
В настоящее время существует значительный интерес к использованию масс-спектрометрии очень высокой чувствительности для исследований микродозирования , которые рассматриваются как многообещающая альтернатива экспериментам на животных .
Недавние исследования показывают, что вторичная ионизация электрораспылением (SESI) является мощным методом мониторинга кинетики лекарств с помощью анализа дыхания. [55] [56] Поскольку дыхание производится естественным путем, можно легко собрать несколько точек данных. Это позволяет значительно увеличить количество собираемых точек данных. [57] В исследованиях на животных этот подход SESI может снизить количество жертвоприношений животных. [56] У людей неинвазивный анализ дыхания SESI-MS может помочь изучить кинетику лекарств на индивидуальном уровне. [55] [58] [59]
Масс-спектрометрия — важный метод характеристики и секвенирования белков. Двумя основными методами ионизации целых белков являются ионизация электрораспылением (ESI) и лазерная десорбция/ионизация с помощью матрицы (MALDI). В соответствии с характеристиками и массовым диапазоном доступных масс-спектрометров для характеристики белков используются два подхода. В первом случае интактные белки ионизируются любым из двух описанных выше методов, а затем вводятся в масс-анализатор. Этот подход называется стратегией анализа белков « сверху вниз ». Однако подход «сверху вниз» в значительной степени ограничен исследованиями одного белка с низкой пропускной способностью. Во втором случае белки ферментативно расщепляются на более мелкие пептиды с использованием протеаз , таких как трипсин или пепсин , либо в растворе , либо в геле после электрофоретического разделения. Также используются другие протеолитические агенты. Сбор пептидных продуктов часто разделяют с помощью хроматографии перед введением в масс-анализатор. Когда для идентификации белка используется характерный образец пептидов, этот метод называется пептидным массовым фингерпринтингом (PMF), если идентификация выполняется с использованием данных последовательности, определенных в тандемном MS- анализе, это называется секвенированием пептидов de novo . Эти процедуры анализа белков также называются подходом « снизу вверх » и также используются для анализа распределения и положения посттрансляционных модификаций, таких как фосфорилирование белков. [60] Третий подход также начинает использоваться, этот промежуточный подход «среднего вниз» включает анализ протеолитических пептидов, которые больше, чем типичный триптический пептид. [61]
В качестве стандартного метода анализа масс-спектрометры достигли других планет и лун. Двое были доставлены на Марс по программе «Викинг» . В начале 2005 года миссия Кассини-Гюйгенс доставила специализированный прибор ГХ-МС на борт зонда Гюйгенс через атмосферу Титана , крупнейшего спутника планеты Сатурн . Этот прибор анализировал образцы атмосферы на траектории спуска и смог испарять и анализировать образцы замороженной, покрытой углеводородами поверхности Титана после приземления зонда. Эти измерения сравнивают содержание изотопов каждой частицы с естественным содержанием на Земле. [62] Также на борту космического корабля «Кассини-Гюйгенс» находился ионный и нейтральный масс-спектрометр, который проводил измерения состава атмосферы Титана, а также состава шлейфов Энцелада . Масс -спектрометр для анализа термических и выделяющихся газов был установлен на посадочном модуле Mars Phoenix Lander , запущенном в 2007 году. [63]
Масс-спектрометры также широко используются в космических миссиях для измерения состава плазмы. Например, на космическом корабле Кассини был установлен плазменный спектрометр Кассини (CAPS) [64] , который измерял массу ионов в магнитосфере Сатурна .
Масс-спектрометры использовались в больницах для анализа дыхательных газов примерно с 1975 года до конца века. Некоторые из них, вероятно, все еще используются, но в настоящее время ни один из них не производится. [65]
Находясь в основном в операционной , они были частью сложной системы, в которой пробы вдыхаемого газа пациентов, находящихся под анестезией , втягивались в прибор через клапанный механизм, предназначенный для последовательного подключения к масс-спектрометру до 32 помещений. Компьютер управлял всеми операциями системы. Данные, собранные с помощью масс-спектрометра, доставлялись в отдельные кабинеты для использования анестезиологом.
Уникальность этого магнитно-секторного масс-спектрометра, возможно, заключалась в том, что плоскость детекторов, каждый из которых специально расположен для сбора всех видов ионов, которые, как ожидается, будут в образцах, позволяла прибору одновременно регистрировать все газы, вдыхаемые пациентом. . Хотя диапазон масс был ограничен чуть более 120 единиц , фрагментация некоторых более тяжелых молекул сводила на нет необходимость в более высоком пределе обнаружения. [66]
Основная функция масс-спектрометрии — инструмент химического анализа, основанный на обнаружении и количественном определении ионов в соответствии с их отношением массы к заряду. Однако масс-спектрометрия также перспективна для синтеза материалов. [48] Мягкая посадка ионов характеризуется осаждением неповрежденных частиц на поверхности при низких кинетических энергиях, что исключает фрагментацию падающих частиц. [67] Впервые о методе мягкой посадки было сообщено в 1977 году для реакции низкоэнергетических серосодержащих ионов на поверхности свинца. [68]