stringtranslate.com

Белок, связывающий мальтозу

Белок, связывающий мальтозу ( MBP ), является частью системы мальтоза / мальтодекстрин Escherichia coli , которая отвечает за поглощение и эффективный катаболизм мальтодекстринов. Это сложная регуляторная и транспортная система, включающая множество белков и белковых комплексов. MBP имеет приблизительную молекулярную массу 42,5 килодальтон .

Структура и складывание

MBP кодируется геном malE Escherichia coli . Ген malE кодирует полипептид-предшественник (396 аминокислотных остатков), который дает зрелый MBP (370 остатков) при расщеплении NH 2 -концевого расширения (26 остатков). Формы-предшественники и зрелые формы MBP не содержат остатков цистеина . [2]

MBP является мономерным белком. Кристаллические структуры показали, что MBP разделен на два отдельных глобулярных домена , которые соединены тремя короткими полипептидными сегментами. Два домена разделены глубокой бороздкой, которая содержит сайт связывания мальтозы/мальтодекстрина. Сравнение структур лигандированной и нелигандированной форм MBP показало, что связывание мальтозы вызывает значительное конформационное изменение , которое закрывает бороздку жестким движением двух доменов вокруг связующего полипептидного шарнира. [3] [4]

Как предшественник, так и зрелая форма MBP функциональны для связывания мальтозы. [5] NH 2 -концевое расширение снижает скорость сворачивания предшественника формы MBP относительно его зрелой формы по крайней мере в 5 раз, но не оказывает влияния на скорость разворачивания. [6] [7] Равновесное разворачивание MBP можно смоделировать с помощью двухстадийного механизма со стабильностью ∆G(H 2 O), равной 9,45 ккал моль −1 при 25 °C, pH 7,6. [8]

Локализация и экспорт

MBP экспортируется в периплазматическое пространство E. coli . [ 9] NH 2 -концевое расширение MBP, также называемое сигнальным пептидом , выполняет две функции: (i) замедляет сворачивание вновь синтезированного полипептида и (ii) направляет этот полипептид к мембране и транслокону SecYEG . После сворачивания предшественник больше не может войти в путь транслокации. [10] Введение заряженного аминокислотного остатка или остатка пролина в гидрофобное ядро ​​сигнального пептида достаточно для блокировки экспорта. [11] Дефектный экспорт мутантных MBP согласуется с альфа-спиральной конформацией и гидрофобными взаимодействиями сигнального пептида при его взаимодействии с транслоконным моторным белком SecA . [12] [13] [14]

Контроль экспрессии

Ген malE , кодирующий MBP, принадлежит Mal-регулону E. coli , который состоит из десяти генов, продукты которых предназначены для эффективного поглощения и использования мальтозы и мальтодекстринов . Все гены, участвующие в транспорте мальтозы/мальтодекстрина, включая malE , сгруппированы в регионе malB E. coli и организованы в два расходящихся оперона : malE-malF-malG и malK-lamB . [15] Стартовые сайты транскрипции на промоторах malEp и malKp находятся на расстоянии 271 пары оснований. [16]

Промоторы malEp и malKp синергически активируются белком MalT, активатором Mal регулона, и белком рецептора цАМФ CRP. Эта активация представляет собой сопряженный процесс, который включает в себя, переходя от malEp к malKp : два сайта связывания MalT; три сайта связывания CRP и два перекрывающихся набора из трех сайтов связывания MalT, смещенных на три пары оснований. [16] [17] [18] Активация транскрипции требует связывания аденозинтрифосфата (АТФ) и мальтотриозы с MalT и связывания циклического АМФ с димером CRP. [19] Нелигандная форма MalT является мономерной, тогда как ее лигандная форма в присутствии АТФ и мальтотриозы является олигомерной. [20]

Использование в качестве вектора белков и пептидов

MBP используется для повышения растворимости рекомбинантных белков, экспрессируемых в E. coli . В этих системах интересующий белок часто экспрессируется как белок слияния MBP , предотвращая агрегацию интересующего белка. Механизм, с помощью которого MBP увеличивает растворимость, не совсем понятен. Кроме того, MBP сам по себе может использоваться в качестве аффинной метки для очистки рекомбинантных белков. Белок слияния связывается с колонками амилозы , в то время как все остальные белки проходят через них. Слияние MBP-белок можно очистить путем элюирования колонки мальтозой. После получения белка слияния в очищенной форме интересующий белок часто расщепляется от MBP с помощью специфической протеазы и затем может быть отделен от MBP с помощью аффинной хроматографии .

Первое исследование связей между структурой и функциями MBP было выполнено путем случайной вставки короткого фрагмента ДНК, кодирующего сайт рестрикции BamHI , в ген malE . Некоторые из вставок повлияли на функции MBP, тогда как другие были разрешающими. [21] [22] Разрешающие сайты, которые были внутренними для MBP, использовались для вставки антигенных пептидов и вызова иммунного ответа у мышей. [23] 3'-OH концевые вставки использовались для создания белков слияния и разработки использования MBP в качестве аффинного маркера для очистки чужеродных белков и пептидов с помощью аффинной хроматографии на сшитой амилозе и элюирования мальтозой в мягких физико-химических условиях. [24] [25] Было разработано несколько плазмидных векторов для облегчения экспрессии и очистки таких белков слияния. [26]

Когда рекомбинантный MBP включает сигнальный пептид , белок слияния может быть экспортирован в периплазматическое пространство , что облегчает его очистку, поскольку периплазматическая жидкость содержит только ограниченное количество белков и может быть извлечена либо с помощью осмотического шока , либо путем пермеабилизации бактериальной внешней мембраны антибиотиками , такими как полимиксин B. Такой экспорт белка слияния в периплазматическое пространство позволяет образовывать дисульфидные связи в белке-пассажире, например, фрагментах антител . [27] [28] Чужеродные белки, которые экспортируются или секретируются в их родном организме, обычно могут быть экспортированы в периплазму E. coli путем слияния с MBP. Примерами цитоплазматических белков, которые могут быть экспортированы путем слияния с MBP, являются мономерная полимераза Кленова и димерный белок Gene V фага M13 . [24] [29] Когда рекомбинантный MBP включает в себя дефектный или отсутствующий сигнальный пептид, белок слияния остается в бактериальной цитоплазме, откуда его можно извлечь, разрушив клетки .

Слияние белков с MBP обычно повышает их растворимость и облегчает их правильное сворачивание, так что белки слияния чаще всего являются бифункциональными. [24] [30] Кроме того, такие слияния могут облегчать кристаллизацию сложных белков, например мембранных белков. Кристаллизованный белок часто может иметь свою структуру, решенную с помощью рентгеновской кристаллографии, используя молекулярную замену на известной структуре MBP. [31]

Смотрите также

Ссылки

  1. ^ Дуань, Сяоцюнь; Холл, Джейсон А; Никайдо, Хироши; Киочо, Флоранте А (март 2001 г.). «Кристаллические структуры белка, связывающего мальтодекстрин/мальтозу, в комплексе с восстановленными олигосахаридами: гибкость третичной структуры и связывание лигандов». Журнал молекулярной биологии . 306 (5): 1115–1126. doi :10.1006/jmbi.2001.4456. PMID  11237621.
  2. ^ Duplay P, Bedouelle H, Fowler A, Zabin I, Saurin W, Hofnung M (август 1984). "Последовательности гена malE и его продукта, белка, связывающего мальтозу, Escherichia coli K12". Журнал биологической химии . 259 (16): 10606–13. doi : 10.1016/S0021-9258(18)91005-7 . PMID  6088507.
  3. ^ Spurlino JC, Lu GY, Quiocho FA (март 1991). «Структура разрешения 2,3-A белка, связывающего мальтозу или мальтодекстрин, первичного рецептора бактериального активного транспорта и хемотаксиса». Журнал биологической химии . 266 (8): 5202–19. doi :10.2210/pdb1mbp/pdb. PMID  2002054.
  4. ^ Sharff AJ, Rodseth LE, Spurlino JC, Quiocho FA (ноябрь 1992 г.). «Кристаллографические доказательства большого лиганд-индуцированного движения шарнира-скручивания между двумя доменами белка, связывающего мальтодекстрин, участвующего в активном транспорте и хемотаксисе». Biochemistry . 31 (44): 10657–63. doi :10.1021/bi00159a003. PMID  1420181.
  5. ^ Ferenci T, Randall LL (октябрь 1979). «Предшественник мальтозосвязывающего белка активен в связывании субстрата». Журнал биологической химии . 254 (20): 9979–81. doi : 10.1016/S0021-9258(19)86659-0 . PMID  385604.
  6. ^ Park S, Liu G, Topping TB, Cover WH, Randall LL (февраль 1988). «Модуляция путей сворачивания экспортируемых белков лидерной последовательностью». Science . 239 (4843): 1033–5. Bibcode :1988Sci...239.1033P. doi :10.1126/science.3278378. PMID  3278378.
  7. ^ Beena K, Udgaonkar JB, Varadarajan R (март 2004 г.). «Влияние сигнального пептида на стабильность и кинетику сворачивания белка, связывающего мальтозу». Биохимия . 43 (12): 3608–19. doi :10.1021/bi0360509. PMID  15035631.
  8. ^ Chun SY, Strobel S, Bassford P, Randall LL (октябрь 1993 г.). «Сворачивание белка, связывающего мальтозу. Доказательства идентичности этапа, определяющего скорость, in vivo и in vitro». Журнал биологической химии . 268 (28): 20855–62. doi : 10.1016/S0021-9258(19)36864-4 . PMID  8407916.
  9. ^ Келлерманн О, Шмельцман С (август 1974). «Активный транспорт мальтозы в Escherichia coli K12. Участие «периплазматического» белка, связывающего мальтозу». European Journal of Biochemistry . 47 (1): 139–49. doi : 10.1111/j.1432-1033.1974.tb03677.x . PMID  4215651.
  10. ^ Рэндалл ЛЛ, Харди СДЖ (сентябрь 1986 г.). «Корреляция компетенции по экспорту с отсутствием третичной структуры зрелых видов: исследование in vivo мальтозосвязывающего белка в E. coli». Cell . 46 (6): 921–8. doi :10.1016/0092-8674(86)90074-7. PMID  3530497. S2CID  28503725.
  11. ^ Bedouelle H, Bassford PJ, Fowler AV, Zabin I, Beckwith J, Hofnung M (май 1980). «Мутации, которые изменяют функцию сигнальной последовательности белка, связывающего мальтозу, Escherichia coli». Nature . 285 (5760): 78–81. Bibcode :1980Natur.285...78B. doi :10.1038/285078a0. PMID  6990274. S2CID  4253747.
  12. ^ Бедуэль Х., Хофнунг М. (1981). «Функциональные последствия анализа вторичной структуры дикого типа и мутантных бактериальных сигнальных пептидов». Прогресс в клинических и биологических исследованиях . 63 : 399–403. PMID  7312870.
  13. ^ Chou YT, Gierasch LM (сентябрь 2005 г.). «Конформация сигнального пептида, связанного с транслоказой SecA препротеина Escherichia coli». Журнал биологической химии . 280 (38): 32753–60. doi : 10.1074/jbc.M507532200 . PMID  16046390.
  14. ^ Гелис I, Бонвин А.М., Керамисану Д., Кукаки М., Гуридис Г., Караману С., Эконому А., Калодимос К.Г. (ноябрь 2007 г.). «Структурная основа распознавания сигнальной последовательности транслоказным мотором SecA, определенная с помощью ЯМР». Клетка . 131 (4): 756–69. дои : 10.1016/j.cell.2007.09.039. ПМК 2170882 . ПМИД  18022369. 
  15. ^ Boos W, Shuman H (март 1998). «Система мальтоза/мальтодекстрин Escherichia coli: транспорт, метаболизм и регуляция». Microbiology and Molecular Biology Reviews . 62 (1): 204–29. doi :10.1128/MMBR.62.1.204-229.1998. PMC 98911 . PMID  9529892. 
  16. ^ ab Bedouelle H, Schmeissner U, Hofnung M, Rosenberg M (ноябрь 1982 г.). «Промоторы оперонов malEFG и malK-lamB в Escherichia coli K12». Журнал молекулярной биологии . 161 (4): 519–31. doi :10.1016/0022-2836(82)90405-3. PMID  6185687.
  17. ^ Bedouelle H (ноябрь 1983 г.). «Мутации в промоторных областях оперонов malEFG и malK-lamB Escherichia coli K12». Журнал молекулярной биологии . 170 (4): 861–82. doi :10.1016/s0022-2836(83)80192-2. PMID  6417341.
  18. ^ Richet E (октябрь 2000 г.). «Синергическая активация транскрипции: двойная роль CRP в активации промотора Escherichia coli в зависимости от MalT и CRP». The EMBO Journal . 19 (19): 5222–32. doi :10.1093/emboj/19.19.5222. PMC 302108. PMID  11013224. 
  19. ^ Richet E, Raibaud O (март 1989). "MalT, регуляторный белок мальтозной системы Escherichia coli, является АТФ-зависимым транскрипционным активатором". The EMBO Journal . 8 (3): 981–7. doi :10.1002/j.1460-2075.1989.tb03461.x. PMC 400900 . PMID  2524384. 
  20. ^ Шрайбер В., Рише Э. (ноябрь 1999 г.). «Самоассоциация активатора транскрипции MalT Escherichia coli в присутствии мальтотриозы и АТФ». Журнал биологической химии . 274 (47): 33220–6. doi : 10.1074/jbc.274.47.33220 . PMID  10559195.
  21. ^ Duplay P, Bedouelle H, Szmelcman S, Hofnung M (1985). «Мутагенез линкера в гене, кодирующем периплазматический белок, связывающий мальтозу, E. coli». Biochimie . 67 (7–8): 849–51. doi :10.1016/s0300-9084(85)80178-4. PMID  3002495.
  22. ^ Duplay P, Szmelcman S, Bedouelle H, Hofnung M (апрель 1987 г.). «Тихие и функциональные изменения в периплазматическом белке, связывающем мальтозу, Escherichia coli K12. I. Транспорт мальтозы». Журнал молекулярной биологии . 194 (4): 663–73. doi :10.1016/0022-2836(87)90243-9. PMID  2821264.
  23. ^ Coëffier E, Clément JM, Cussac V, Khodaei-Boorane N, Jehanno M, Rojas M, Dridi A, Latour M, El Habib R, Barré-Sinoussi F, Hofnung M, Leclerc C (ноябрь 2000 г.). «Антигенность и иммуногенность эпитопа ВИЧ-1 gp41 ELDKWA, вставленного в разрешающие сайты белка MalE». Вакцина . 19 (7–8): 684–93. doi :10.1016/s0264-410x(00)00267-x. PMID  11115689.
  24. ^ abc Bedouelle H, Duplay P (февраль 1988). «Производство в Escherichia coli и одношаговая очистка бифункциональных гибридных белков, связывающих мальтозу. Экспорт полимеразы Кленова в периплазматическое пространство». European Journal of Biochemistry . 171 (3): 541–9. doi : 10.1111/j.1432-1033.1988.tb13823.x . PMID  3278900.
  25. ^ Rondard P, Brégégère F, Lecroisey A, Delepierre M, Bedouelle H (июль 1997 г.). «Конформационные и функциональные свойства эпитопа ундекапептида, слитого с С-терминальным концом белка, связывающего мальтозу». Biochemistry . 36 (29): 8954–61. CiteSeerX 10.1.1.599.2650 . doi :10.1021/bi962508d. PMID  9220983. 
  26. ^ di Guan C, Li P, Riggs PD, Inouye H (июль 1988). «Векторы, облегчающие экспрессию и очистку чужеродных пептидов в Escherichia coli путем слияния с белком, связывающим мальтозу». Gene . 67 (1): 21–30. doi :10.1016/0378-1119(88)90004-2. PMID  2843437.
  27. ^ Brégégère F, Schwartz J, Bedouelle H (февраль 1994). «Бифункциональные гибриды между вариабельными доменами иммуноглобулина и мальтозосвязывающим белком Escherichia coli: производство, очистка и связывание антигена». Protein Engineering . 7 (2): 271–80. PMID  8170930.
  28. ^ Малик А. (июнь 2016 г.). «Теги слияния белков для эффективной экспрессии и очистки рекомбинантных белков в периплазматическом пространстве E. coli». 3 Biotech . 6 (1): 44. doi :10.1007/s13205-016-0397-7. PMC 4742420. PMID  28330113 . 
  29. ^ Блондель А., Бедуэль Х. (октябрь 1990 г.). «Экспорт и очистка цитоплазматического димерного белка путем слияния с белком, связывающим мальтозу, Escherichia coli». European Journal of Biochemistry . 193 (2): 325–30. doi : 10.1111/j.1432-1033.1990.tb19341.x . PMID  2226455.
  30. ^ Kapust RB, Waugh DS (август 1999). «Мальтозосвязывающий белок Escherichia coli необычайно эффективен в повышении растворимости полипептидов, с которыми он слит». Protein Science . 8 (8): 1668–74. doi :10.1110/ps.8.8.1668. PMC 2144417 . PMID  10452611. 
  31. ^ Waugh DS (март 2016 г.). «Кристаллические структуры белков слияния MBP». Protein Science . 25 (3): 559–71. doi :10.1002/pro.2863. PMC 4815407 . PMID  26682969. 

Внешние ссылки