Микроматрица — это мультиплексная лаборатория на чипе . [1] Его цель — одновременно обнаружить проявление тысяч биологических взаимодействий. Это двумерный массив на твердой подложке — обычно предметное стекло или тонкопленочная кремниевая ячейка — который анализирует (тестирует) большие количества биологического материала с использованием высокопроизводительного скрининга , миниатюрных, мультиплексных и параллельных методов обработки и обнаружения. Концепция и методология микрочипов была впервые представлена и проиллюстрирована в микрочипах антител (также называемых матрицей антител ) Цзе Вэнь Чаном в 1983 году в научной публикации [2] и серии патентов. [3] [4] [5] Индустрия « генных чипов » начала значительно расти после публикации в журнале Science Magazine в 1995 году статьи, написанной лабораториями Рона Дэвиса и Пэта Брауна в Стэнфордском университете. [6] С созданием таких компаний, как Affymetrix , Agilent , Applied Microarrays, Arrayjet, Illumina и других, технология ДНК-микрочипов стала наиболее сложной и наиболее широко используемой, в то время как использование белков, пептидов и углеводов микрочипов [7] расширяется.
Типы микрочипов включают в себя:
Специалисты в области биотехнологии КМОП разрабатывают новые виды микрочипов. После подачи магнитных наночастиц отдельные клетки могут перемещаться независимо и одновременно по микроматрице магнитных катушек. Разрабатывается микрочип микрокатушек ядерного магнитного резонанса . [8]
В основе платформы микрочипов лежит большое количество технологий, включая материальные подложки, [9] нанесение биомолекулярных массивов, [10] и микрофлюидную упаковку массивов. [11] Микрочипы можно разделить на категории по тому, как они физически изолируют каждый элемент массива: путем точечного (создание небольших физических лунок), синтеза на чипе (синтез целевых ДНК-зондов, прикрепленных непосредственно к массиву) или на основе шариков (приклеивание образцы в шарики со штрих-кодом, случайно распределенные по массиву). [12]
Первая публикация о процессе производства микрочипов датируется 1995 годом, когда 48 кДНК растения были напечатаны на предметном стекле, обычно используемом для световой микроскопии; с другой стороны, современные микрочипы включают в себя тысячи зондов и различные носители с покрытиями. Для изготовления микроматрицы требуется как биологическая, так и физическая информация, включая библиотеки образцов, принтеры и подложки для слайдов. Хотя все процедуры и решения всегда зависят от используемой технологии изготовления. Основной принцип микрочипа заключается в печати небольших пятен растворов, содержащих разные виды зонда, на предметном стекле несколько тысяч раз. [13]
Современные принтеры оснащены HEPA -фильтром и имеют контролируемую влажность и температуру окружающей среды, которая обычно составляет около 25°C, влажность 50%. Ранние микрочипы печатались непосредственно на поверхности с помощью иголок принтера, которые наносили образцы на предметное стекло по заданному пользователем шаблону. Современные методы работают быстрее, вызывают меньше перекрестного загрязнения и обеспечивают лучшую морфологию пятен. Для микрочипов высокой плотности поверхность, на которой напечатаны зонды, должна быть чистой, свободной от пыли и гидрофобной. Покрытия для предметных стекол включают поли-L-лизин, аминосилан, эпоксидную смолу и другие, в том числе растворы производителей, и выбираются в зависимости от типа используемого образца. Постоянные усилия по развитию технологии микрочипов направлены на создание однородных, плотных массивов при одновременном уменьшении необходимого объема раствора и минимизации загрязнения или повреждения. [13] [14]
Для производственного процесса необходима библиотека образцов, содержащая всю необходимую информацию. На ранних стадиях технологии микрочипов единственным используемым образцом была ДНК , полученная из общедоступных библиотек клонов и полученная путем амплификации ДНК с помощью бактериальных векторов. Современные подходы больше не включают в качестве образца только ДНК , но также белки, антитела, антигены, гликаны, клеточные лизаты и другие небольшие молекулы. Все используемые образцы предварительно синтезированы, регулярно обновляются и их проще поддерживать. Методы изготовления массивов включают контактную печать, литографию, бесконтактную и бесклеточную печать. [14]
Микроматрица контактной печати включает в себя игольчатую печать, микроштамповку или поточную печать. Игольная печать — старейшая и до сих пор наиболее широко применяемая методология контактной печати микрочипов ДНК . В этом методе используются такие типы штифтов, как сплошные штифты, разрезные или игольчатые штифты, для загрузки и доставки раствора образца непосредственно на твердые поверхности микроматрицы. Микроштамповка предлагает альтернативу широко используемой игольной печати и также называется мягкой литографией , которая теоретически охватывает различные связанные технологии переноса рисунка с использованием узорчатых полимерных монолитных подложек, наиболее известной из которых является микроштамповка. В отличие от игольной печати, микроштамповка представляет собой более параллельный метод нанесения с меньшей индивидуальностью. Некоторые марки загружаются реагентами и печатаются с использованием этих растворов реагентов одинаково. [15]
Литография сочетает в себе различные методы, такие как фотолитография, интерференционная литография, лазерное письмо, электронно-лучевое письмо и перо. Наиболее широко используемым и исследованным методом остается фотолитография, при которой фотолитографические маски используются для нацеливания определенных нуклеотидов на поверхность. УФ-свет проходит через маску, которая действует как фильтр, пропуская или блокируя свет от химически защищенной поверхности микрочипа. Если УФ-свет заблокирован, область останется защищенной от добавления нуклеотидов, тогда как в области, подвергшиеся воздействию УФ-света, можно добавить дополнительные нуклеотиды. С помощью этого метода можно создавать высококачественные индивидуальные массивы с очень высокой плотностью элементов ДНК с помощью компактного устройства с небольшим количеством движущихся частей. [16] [17]
Методы бесконтактной печати варьируются от фотохимической печати, электропечати и капельного нанесения. В отличие от других методов, бесконтактная печать не предполагает контакта поверхности со штампом, булавкой или другим использованным дозатором. Основными преимуществами являются снижение загрязнения, меньшая очистка и более высокая производительность, которая постоянно увеличивается. Многие методы позволяют загружать зонды параллельно, что позволяет создавать несколько массивов одновременно. [14] [15]
В бесклеточных системах транскрипция и трансляция осуществляются in situ, что делает клонирование и экспрессию белков в клетках-хозяевах устаревшими, поскольку интактные клетки не нужны. Интересующая молекула синтезируется непосредственно на поверхности твердого тела. Эти анализы позволяют проводить высокопроизводительный анализ в контролируемой среде без выводов, связанных с неповрежденными клетками. [18]