stringtranslate.com

Кристаллизация белка

Кристаллы белков, выращенные на американском космическом корабле «Шаттл» или российской космической станции «Мир» .

Кристаллизация белка — это процесс формирования регулярного массива отдельных молекул белка, стабилизированных кристаллическими контактами. Если кристалл достаточно упорядочен, он будет дифрагировать . Некоторые белки естественным образом образуют кристаллические массивы, например аквапорин в хрусталике глаза. [1] [2]

В процессе кристаллизации белка белки растворяются в водной среде и растворе образца до тех пор, пока не достигнут перенасыщенного состояния . [3] Для достижения этого состояния используются различные методы, такие как диффузия паров, микропартии, микродиализ и диффузия со свободным интерфейсом. Разработка кристаллов белка — сложный процесс, на который влияют многие факторы, включая pH, температуру, ионную силу в растворе для кристаллизации и даже гравитацию. [3] После формирования эти кристаллы могут использоваться в структурной биологии для изучения молекулярной структуры белка, в частности, для различных промышленных или медицинских целей. [4] [5]

Разработка

Уже более 150 лет ученые со всего мира знают о кристаллизации белковых молекул. [6]

В 1840 году Фридрих Людвиг Хюнефельд случайно обнаружил образование кристаллического материала в образцах крови дождевого червя, помещенных под два предметных стекла, и время от времени наблюдал небольшие пластинчатые кристаллы в высушенных образцах свиной или человеческой крови. Эти кристаллы были названы «гемоглобином» Феликсом Хоппе-Зейлером в 1864 году. Основополагающие открытия Хюнефельда вдохновили многих ученых в будущем. [7]

В 1851 году Отто Функе описал процесс получения кристаллов человеческого гемоглобина путем разбавления эритроцитов растворителями, такими как чистая вода, спирт или эфир, с последующим медленным испарением растворителя из белкового раствора. В 1871 году Уильям Т. Прейер, профессор Йенского университета, опубликовал книгу под названием Die Blutkrystalle (Кристаллы крови), в которой были рассмотрены особенности кристаллов гемоглобина примерно 50 видов млекопитающих, птиц, рептилий и рыб. [7]

В 1909 году физиолог Эдвард Т. Рейхерт совместно с минералогом Амосом П. Брауном опубликовали трактат о приготовлении, физиологии и геометрической характеристике кристаллов гемоглобина из нескольких сотен животных, включая вымершие виды, такие как тасманийский волк. [7] Было обнаружено увеличение кристаллов белка.

В 1934 году Джон Десмонд Бернал и его студентка Дороти Ходжкин обнаружили, что кристаллы белка, окруженные маточным раствором, дают лучшие дифракционные картины, чем высушенные кристаллы. Используя пепсин , они были первыми, кто различил дифракционную картину влажного, глобулярного белка. До Бернала и Ходжкина кристаллография белка проводилась только в сухих условиях с непоследовательными и ненадежными результатами. Это первая рентгенодифракционная картина кристалла белка. [8]

В 1958 году структура миоглобина (красного белка, содержащего гем), определенная методом рентгеновской кристаллографии, была впервые описана Джоном Кендрю . [9] Кендрю разделил Нобелевскую премию по химии 1962 года с Максом Перуцем за это открытие. [4]

В настоящее время структуры белковых кристаллов играют важную роль в биохимии и трансляционной медицине.

Фон

Кристаллы лизоцима , наблюдаемые через поляризационный фильтр.

Теория кристаллизации белка

Кристаллизация белка регулируется той же физикой, которая управляет образованием неорганических кристаллов. Для того, чтобы кристаллизация произошла спонтанно, кристаллическое состояние должно быть благоприятным термодинамически. Это описывается свободной энергией Гиббса (∆G), определяемой как ∆G = ∆H- T∆S, которая отражает, как изменение энтальпии процесса, ∆H, компенсируется соответствующим изменением энтропии , ∆S. [10] Энтропия, грубо говоря, описывает беспорядок системы. Высокоупорядоченные состояния, такие как кристаллы белка, неблагоприятны термодинамически по сравнению с более неупорядоченными состояниями, такими как растворы белков в растворителе, потому что переход в более упорядоченное состояние уменьшил бы общую энтропию системы (положительное ∆S). Для того, чтобы кристаллы образовывались спонтанно, ∆G образования кристалла должно быть отрицательным. Другими словами, энтропийный штраф должен быть оплачен соответствующим уменьшением общей энергии системы (∆H). Знакомые неорганические кристаллы, такие как хлорид натрия, спонтанно образуются в условиях окружающей среды, поскольку кристаллическое состояние уменьшает общую энергию системы. Однако кристаллизация некоторых белков в условиях окружающей среды как уменьшит энтропию (положительная ∆S), так и увеличит общую энергию (положительная ∆H) системы, и, таким образом, не происходит спонтанно. Для достижения кристаллизации таких белков условия изменяются, чтобы сделать образование кристаллов энергетически выгодным. Это часто достигается путем создания перенасыщенного раствора образца. [3]

Молекулярный вид, переходящий от раствора к кристаллу

Образование кристаллов требует двух этапов: зародышеобразование и рост . [3] Зародышеобразование является инициирующим этапом кристаллизации. [3] На этапе зародышеобразования молекулы белка в растворе объединяются в агрегаты, образуя стабильное твердое ядро. [3] По мере формирования ядра кристалл становится все больше и больше за счет молекул, прикрепляющихся к этому стабильному ядру. [3] Этап зародышеобразования имеет решающее значение для образования кристаллов, поскольку он представляет собой фазовый переход первого порядка образцов, переходящих из состояния с высокой степенью свободы в состояние, упорядоченное (из водного в твердое). [3] Для успешного этапа зародышеобразования необходимо манипулировать параметрами кристаллизации. Подход, лежащий в основе кристаллизации белка, заключается в достижении более низкой растворимости целевого белка в растворе. [3] После того, как предел растворимости превышен и кристаллы присутствуют, кристаллизация завершается. [3]

Методы

Диффузия пара

Три метода приготовления кристаллов: A: Висячая капля. B: Сидячая капля. C: Микродиализ

Диффузия паров является наиболее часто используемым методом кристаллизации белка. В этом методе капли, содержащие очищенный белок, буфер и осадитель, уравновешиваются с большим резервуаром, содержащим аналогичные буферы и осадители в более высоких концентрациях. Первоначально капля раствора белка содержит сравнительно низкие концентрации осадителя и белка, но по мере того, как капля и резервуар уравновешиваются, концентрации осадителя и белка в капле увеличиваются. Если для данного белка используются соответствующие растворы для кристаллизации, в капле происходит рост кристаллов. [11] [12] Этот метод используется, потому что он позволяет плавно и постепенно изменять концентрацию белка и концентрацию осадителя, что способствует росту больших и хорошо упорядоченных кристаллов.

Диффузия паров может осуществляться в формате «висящей капли» или «сидящей капли». Аппарат «висящей капли» включает каплю белкового раствора, помещенную на перевернутое покровное стекло, которое затем подвешивается над резервуаром. Аппарат кристаллизации «сидящей капли» помещает каплю на пьедестал, отделенный от резервуара. Оба эти метода требуют герметизации среды, чтобы могло произойти равновесие между каплей и резервуаром. [11] [13]

Микропартия

Микропартия обычно включает погружение очень небольшого объема белковых капель в масло (всего 1 мкл). Причина, по которой требуется масло, заключается в том, что используется такой малый объем белкового раствора, и поэтому испарение должно быть подавлено для проведения эксперимента в водной среде. Хотя существуют различные масла, которые можно использовать, два наиболее распространенных герметика — это парафиновые масла (описанные Чайеном и др.) и силиконовые масла (описанные Д'Арси). Существуют также другие методы микропартий, которые не используют жидкий герметик и вместо этого требуют, чтобы ученый быстро поместил пленку или ленту на лунку после помещения капли в лунку.

Помимо очень ограниченного количества необходимого образца, этот метод имеет еще одно преимущество: образцы защищены от загрязнения воздухом, поскольку они никогда не подвергаются воздействию воздуха во время эксперимента.

Микродиализ

Микродиализ использует полупроницаемую мембрану , через которую могут проходить небольшие молекулы и ионы, в то время как белки и крупные полимеры не могут. Устанавливая градиент концентрации растворенного вещества через мембрану и позволяя системе продвигаться к равновесию, система может медленно двигаться к пересыщению, в точке которого могут образовываться кристаллы белка.

Микродиализ может производить кристаллы путем высаливания , используя высокие концентрации соли или других небольших мембранопроницаемых соединений, которые снижают растворимость белка. Очень редко некоторые белки могут быть кристаллизованы путем диализа с высаливанием, путем диализа против чистой воды, удаления растворенных веществ, управления самоассоциацией и кристаллизацией.

Свободная диффузия интерфейса

Эта техника объединяет белковые и осадочные растворы без предварительного смешивания, а вместо этого впрыскивает их через обе стороны канала, обеспечивая равновесие посредством диффузии. Два раствора контактируют в камере реагента, оба при максимальных концентрациях, инициируя спонтанное зародышеобразование. Когда система приходит в равновесие, уровень пересыщения уменьшается, что благоприятствует росту кристаллов. [14]

Факторы влияния

рН

Основной движущей силой кристаллизации белка является оптимизация количества связей, которые можно образовать с другим белком посредством межмолекулярных взаимодействий. [3] Эти взаимодействия зависят от электронной плотности молекул и боковых цепей белка, которые изменяются в зависимости от pH . [10] Третичная и четвертичная структура белков определяется межмолекулярными взаимодействиями между боковыми группами аминокислот, в которых гидрофильные группы обычно обращены наружу к раствору, образуя гидратную оболочку для растворителя (воды). [ 10] По мере изменения pH заряд на этих полярных боковых группах также изменяется по отношению к pH раствора и pKa белка . Следовательно, выбор pH имеет важное значение либо для содействия образованию кристаллов, где связь между молекулами друг с другом более благоприятна, чем с молекулами воды. [10] pH является одной из самых мощных манипуляций, которые можно назначить для оптимального условия кристаллизации.

Температура

Температура — еще один интересный параметр для обсуждения, поскольку растворимость белка является функцией температуры. [15] При кристаллизации белка манипуляция температурой для получения успешных кристаллов является одной из распространенных стратегий. В отличие от pH, температура различных компонентов экспериментов по кристаллографии может влиять на конечные результаты, такие как температура приготовления буфера, [16] температура фактического эксперимента по кристаллизации и т. д.

Химические добавки

Химические добавки — это небольшие химические соединения, которые добавляются в процесс кристаллизации для увеличения выхода кристаллов. [17] Роль малых молекул в кристаллизации белка не была хорошо изучена в первые дни, поскольку в большинстве случаев они считались загрязняющими веществами. [17] Более мелкие молекулы кристаллизуются лучше, чем макромолекулы, такие как белки, поэтому использование химических добавок было ограничено до исследования Макферсона. Однако это мощный аспект экспериментальных параметров кристаллизации, который важен для биохимиков и кристаллографов для дальнейшего изучения и применения. [17]

Технологии

Высокопроизводительное кристаллизационное скрининговое исследование

Существуют методы высокой пропускной способности, помогающие оптимизировать большое количество экспериментов, необходимых для изучения различных условий, необходимых для успешного роста кристаллов. Существует множество коммерческих наборов, доступных для заказа, которые используют предварительно собранные ингредиенты в системах, гарантированно обеспечивающих успешную кристаллизацию. Используя такой набор, ученый избегает хлопот по очистке белка и определению соответствующих условий кристаллизации. [18]

Роботы для обработки жидкостей могут использоваться для настройки и автоматизации большого количества экспериментов по кристаллизации одновременно. То, что в противном случае было бы медленным и потенциально подверженным ошибкам процессом, выполняемым человеком, может быть выполнено эффективно и точно с помощью автоматизированной системы. Роботизированные системы кристаллизации используют те же компоненты, описанные выше, но выполняют каждый шаг процедуры быстро и с большим количеством повторений. В каждом эксперименте используются крошечные количества раствора, и преимущество меньшего размера является двойным: меньшие размеры образцов не только сокращают расход очищенного белка, но и меньшие количества раствора приводят к более быстрой кристаллизации. Каждый эксперимент контролируется камерой, которая обнаруживает рост кристаллов. [12]

Белковая инженерия

Белки можно конструировать для повышения вероятности успешной кристаллизации белка, используя такие методы, как снижение поверхностной энтропии [19] или конструирование в кристаллических контактах. [20] Часто проблемные остатки цистеина можно заменить аланином, чтобы избежать агрегации, опосредованной дисульфидом , а такие остатки, как лизин, глутамат и глутамин, можно заменить на аланин, чтобы снизить внутреннюю гибкость белка, что может препятствовать кристаллизации.

Приложения

Макромолекулярные структуры могут быть определены из кристалла белка с использованием различных методов, включая рентгеновскую дифракцию / рентгеновскую кристаллографию , криогенную электронную микроскопию (CryoEM) (включая электронную кристаллографию и микрокристаллическую электронную дифракцию (MicroED) ), малоугловое рентгеновское рассеяние и нейтронную дифракцию . См. также Структурная биология .

Кристаллизация белков также может быть полезна при разработке белков для фармацевтических целей. [21]

Смотрите также

Ссылки

  1. ^ Шей К.Л., Ван З., Л. Венке Дж., Ци Ю (май 2014 г.). «Аквапорины в глазах: выражение, функции и роль при заболеваниях глаз». Biochimica et Biophysical Acta (BBA) – Общие предметы . 1840 (5): 1513–1523. дои : 10.1016/j.bbagen.2013.10.037. ПМЦ  4572841 . ПМИД  24184915.
  2. ^ Gonen T, Cheng Y, Sliz P, Hiroaki Y, Fujiyoshi Y, Harrison SC, Walz T (декабрь 2005 г.). «Взаимодействия липидов и белков в двухслойных двумерных кристаллах AQP0». Nature . 438 (7068): 633–638. Bibcode :2005Natur.438..633G. doi :10.1038/nature04321. PMC 1350984 . PMID  16319884. 
  3. ^ abcdefghijk McPherson A, Gavira JA (январь 2014). «Введение в кристаллизацию белков». Acta Crystallographica. Раздел F, Structural Biology Communications . 70 (Pt 1): 2–20. Bibcode :2014AcCrF..70....2M. doi :10.1107/s2053230x13033141. PMC 3943105 . PMID  24419610. 
  4. ^ ab Blundell TL (июль 2017 г.). «Кристаллография белков и открытие лекарств: воспоминания об обмене знаниями между академическими кругами и промышленностью». IUCrJ . 4 (Pt 4): 308–321. Bibcode :2017IUCrJ...4..308B. doi :10.1107/s2052252517009241. PMC 5571795 . PMID  28875019. 
  5. ^ Tripathy D, Bardia A, Sellers WR (июль 2017 г.). «Рибоциклиб (LEE011): механизм действия и клиническое воздействие этого селективного ингибитора циклин-зависимой киназы 4/6 на различные солидные опухоли». Clinical Cancer Research . 23 (13): 3251–3262. doi :10.1158/1078-0432.ccr-16-3157. PMC 5727901 . PMID  28351928. 
  6. ^ McPherson A (март 1991). «Краткая история роста кристаллов белка». Journal of Crystal Growth . 110 (1–2): 1–10. Bibcode : 1991JCrGr.110....1M. doi : 10.1016/0022-0248(91)90859-4. ISSN  0022-0248.
  7. ^ abc Giegé R (декабрь 2013 г.). «Исторический взгляд на кристаллизацию белка с 1840 года по настоящее время». Журнал FEBS . 280 (24): 6456–6497. doi : 10.1111/febs.12580 . PMID  24165393.
  8. ^ Тулинский А (1996). "Глава 35. Проект структуры белка, 1950–1959: Первая согласованная попытка определения структуры белка в США". Annual Reports in Medicinal Chemistry . 31. Elsevier: 357–366. doi :10.1016/s0065-7743(08)60474-1. ISBN 9780120405312.
  9. ^ Kendrew JC, Bodo G, Dintzis HM, Parrish RG, Wyckoff H, Phillips DC (март 1958). «Трехмерная модель молекулы миоглобина, полученная с помощью рентгеновского анализа». Nature . 181 (4610): 662–666. Bibcode :1958Natur.181..662K. doi :10.1038/181662a0. PMID  13517261. S2CID  4162786.
  10. ^ abcd Boyle J (январь 2005 г.). «Принципы биохимии Ленингера (4-е изд.): Нельсон, Д. и Кокс, М.» Биохимия и образование в области молекулярной биологии . 33 (1): 74–75. doi : 10.1002/bmb.2005.494033010419 . ISSN  1470-8175.
  11. ^ ab Rhodes G (2006). Кристаллография, сделанная кристально чистой: руководство для пользователей макромолекулярных моделей (третье изд.). Academic Press.
  12. ^ ab "The Crystal Robot". Декабрь 2000. Получено 2003-02-18 .
  13. ^ McRee D (1993). Практическая кристаллография белков. Сан-Диего: Academic Press. С. 1–23. ISBN 978-0-12-486052-0.
  14. ^ Рапп Б. (20 октября 2009 г.). Биомолекулярная кристаллография: принципы, практика и применение в структурной биологии. Garland Science. стр. 800. ISBN 9781134064199. Получено 28 декабря 2016 г.
  15. ^ Pelegrine DH, Gasparetto CA (февраль 2005 г.). «Растворимость сывороточных белков как функция температуры и pH». LWT — Пищевая наука и технология . 38 (1): 77–80. doi :10.1016/j.lwt.2004.03.013. ISSN  0023-6438.
  16. ^ Chen RQ, Lu QQ, Cheng QD, Ao LB, Zhang CY, Hou H и др. (январь 2015 г.). "Игнорируемая переменная: температура приготовления раствора при кристаллизации белка". Scientific Reports . 5 (1): 7797. Bibcode :2015NatSR...5E7797C. doi :10.1038/srep07797. PMC 4297974 . PMID  25597864. 
  17. ^ abc McPherson A, Cudney B (декабрь 2006 г.). «Поиск серебряных пуль: альтернативная стратегия кристаллизации макромолекул». Журнал структурной биологии . 156 (3): 387–406. doi :10.1016/j.jsb.2006.09.006. PMID  17101277. S2CID  10944540.
  18. ^ Lin Y (август 2018 г.). «Что произошло за последние пять лет с высокопроизводительным скринингом кристаллизации белков?». Мнение эксперта по открытию лекарств . 13 (8): 691–695. doi : 10.1080/17460441.2018.1465924 . PMID  29676184.
  19. ^ Cooper DR, Boczek T, Grelewska K, Pinkowska M, Sikorska M, Zawadzki M, Derewenda Z (май 2007). «Кристаллизация белка путем снижения поверхностной энтропии: оптимизация стратегии SER». Acta Crystallographica. Раздел D, Биологическая кристаллография . 63 (Pt 5): 636–645. doi :10.1107/S0907444907010931. PMID  17452789.
  20. ^ Гонен С., ДиМайо Ф., Гонен Т., Бейкер Д. (июнь 2015 г.). «Проектирование упорядоченных двумерных массивов, опосредованных нековалентными белок-белковыми интерфейсами». Science . 348 (6241): 1365–1368. Bibcode :2015Sci...348.1365G. doi : 10.1126/science.aaa9897 . PMID  26089516.
  21. ^ Jen A, Merkle HP (ноябрь 2001 г.). «Необработанные алмазы: кристаллы белка с точки зрения формулирования». Pharmaceutical Research . 18 (11): 1483–8. doi :10.1023/a:1013057825942. PMID  11758753. S2CID  21801946.

Дальнейшее чтение

Внешние ссылки