В световой микроскопии масляная иммерсия — это метод, используемый для повышения разрешающей способности микроскопа . Это достигается путем погружения объектива и образца в прозрачное масло с высоким показателем преломления , тем самым увеличивая числовую апертуру объектива.
Без масла световые волны отражаются от предметного стекла через покровное стекло, через воздух и в линзу микроскопа (см. цветной рисунок справа). Если волна не выходит под углом 90 градусов, она изгибается при столкновении с новым веществом, величина изгиба зависит от угла. Это искажает изображение. Воздух имеет совершенно другой показатель преломления, чем стекло, что приводит к большему изгибу по сравнению с маслом, у которого показатель преломления более близок к стеклу. Специально изготовленное масло может иметь почти такой же показатель преломления, как и стекло, что делает линзу, погруженную в масло, почти такой же эффективной, как и стекло, полностью окружающее образец (что было бы непрактично).
Иммерсионные масла — это прозрачные масла, которые имеют особые оптические и вязкостные характеристики, необходимые для использования в микроскопии. Типичные используемые масла имеют показатель преломления около 1,515. [1] Масляный иммерсионный объектив — это линза объектива, специально разработанная для использования таким образом. Многие конденсоры также дают оптимальное разрешение, когда линза конденсора погружена в масло.
Линзы восстанавливают свет, рассеянный объектом. Для успешного достижения этой цели в идеале должны быть собраны все порядки дифракции. Это связано с углом раскрытия линзы и ее показателем преломления. Разрешение микроскопа определяется как минимальное расстояние, необходимое между двумя исследуемыми объектами, чтобы микроскоп мог различить их как отдельные объекты. Это минимальное расстояние обозначается δ. Если два объекта разделены расстоянием, меньшим δ, они будут отображаться в микроскопе как один объект.
Мера разрешающей способности, RP, объектива определяется его числовой апертурой , NA:
где λ — длина волны света. Из этого ясно, что хорошее разрешение (малое δ) связано с высокой числовой апертурой.
Числовая апертура объектива определяется как
где α 0 — половина угла, охватываемого линзой объектива, видимого со стороны образца, а n — показатель преломления среды между линзой и образцом (≈1 для воздуха).
Современные объективы могут иметь числовую апертуру до 0,95. Поскольку sin α 0 всегда меньше или равен единице (числу «1»), числовая апертура никогда не может быть больше единицы для объектива в воздухе. Однако, если пространство между объективом и образцом заполнено маслом, числовая апертура может принимать значения больше единицы. Это происходит потому, что показатель преломления масла больше 1.
Из вышесказанного следует, что масло между образцом и объективом улучшает разрешающую способность в 1/ n раз . Объективы, специально разработанные для этой цели, известны как объективы с масляной иммерсией.
Масляные иммерсионные объективы используются только при очень больших увеличениях, требующих высокой разрешающей способности. Объективы с большим увеличением имеют короткие фокусные расстояния , что облегчает использование масла. Масло наносится на образец (обычный микроскоп), и столик поднимается, погружая объектив в масло. (В инвертированных микроскопах масло наносится на объектив).
Показатели преломления масла и стекла в первом элементе линзы почти одинаковы, что означает, что преломление света при входе в линзу будет небольшим (масло и стекло оптически очень похожи). Для обеспечения близкого соответствия показателей преломления необходимо использовать правильное иммерсионное масло для объектива . Использование иммерсионной масляной линзы с неправильным иммерсионным маслом или вообще без иммерсионного масла приведет к сферической аберрации. Сила этого эффекта зависит от величины несоответствия показателей преломления.
Масляную иммерсию обычно можно использовать только на жестко закрепленных образцах, в противном случае поверхностное натяжение масла может сместить покровное стекло и, таким образом, сместить образец под ним. Это может также произойти в инвертированных микроскопах, поскольку покровное стекло находится под предметным стеклом.
До разработки синтетических иммерсионных масел в 1940-х годах широко использовалось кедровое масло . Кедровое масло имеет показатель преломления приблизительно 1,516. Числовая апертура объективов с кедровым маслом обычно составляет около 1,3. Однако кедровое масло имеет ряд недостатков: оно поглощает синий и ультрафиолетовый свет, желтеет со временем, имеет достаточную кислотность, чтобы потенциально повредить объективы при повторном использовании (разъедая цемент, используемый для соединения линз ), а разбавление его растворителем изменяет его вязкость (и показатель преломления и дисперсию ). Кедровое масло необходимо удалять из объектива сразу после использования, прежде чем оно затвердеет, поскольку удаление затвердевшего кедрового масла может повредить линзу. [2]
В современной микроскопии чаще используются синтетические иммерсионные масла, поскольку они устраняют большинство этих проблем. [2] Значения NA 1,6 могут быть достигнуты с помощью различных масел. В отличие от натуральных масел, синтетические не затвердевают на линзе и обычно могут оставаться на объективе в течение нескольких месяцев, хотя для лучшего обслуживания микроскопа лучше всего ежедневно удалять масло. Со временем масло может попасть на переднюю линзу объектива или в ствол объектива и повредить объектив. Существуют различные типы иммерсионных масел с различными свойствами в зависимости от типа микроскопии, которую вы будете выполнять. Тип A и тип B являются иммерсионными маслами общего назначения с различной вязкостью. Иммерсионное масло типа F лучше всего использовать для флуоресцентной визуализации при комнатной температуре (23 °C), в то время как масло типа N предназначено для использования при температуре тела (37 °C) для визуализации живых клеток. Все они имеют D 1,515, что очень похоже на исходное кедровое масло. [3]
