Фотоактивируемые зонды , или зонды в клетках , являются клеточными игроками ( белки , нуклеиновые кислоты , малые молекулы ), которые могут быть активированы вспышкой света. Они используются в биологических исследованиях для изучения процессов в клетках. Основной принцип заключается в том, чтобы доставить фотоактивируемый агент (например, малую молекулу, модифицированную светочувствительной группой: белки, помеченные искусственным фоторецепторным белком ) к клеткам, тканям или даже живым животным и специально контролировать его активность с помощью освещения. [1]
Свет является хорошо подходящим внешним триггером для подобных экспериментов, поскольку он неинвазивен и не влияет на нормальные клеточные процессы (хотя необходимо соблюдать осторожность при использовании света в ультрафиолетовой части спектра, чтобы избежать повреждения ДНК ). Кроме того, свет обеспечивает высокий пространственный и временной контроль. Обычно стимул активации исходит от лазера или УФ-лампы и может быть встроен в тот же микроскоп, который используется для мониторинга эффекта. Все эти преимущества привели к разработке большого разнообразия различных фотоактивируемых зондов.
Несмотря на то, что этап активации под действием света обычно необратим, в ряде фотопереключателей могут быть вызваны обратимые изменения .
Первое зарегистрированное использование фотозащищенных аналогов для биологических исследований было синтезом и применением АТФ в клетке Джозефом Ф. Хоффманом в 1978 году [2] в его исследовании насосов Na:K . По состоянию на 2013 год АТФ по-прежнему является наиболее часто используемым соединением в клетке. Хоффман также был тем, кто придумал термин «в клетке» для этого типа модифицированных молекул. Эта номенклатура сохранилась, несмотря на то, что с научной точки зрения она является неправильным названием , поскольку предполагает идею о том, что молекула находится в физической клетке (как в фуллерене ). Однако ученые попытались ввести более новый, более точный термин «фотоактивируемые зонды». В настоящее время используются обе номенклатуры.
Основные открытия были сделаны в последующие годы с использованием нейротрансмиттеров , таких как глутамат , который используется для картирования функциональных нейронных цепей в срезах мозга млекопитающих . [3] Малые молекулы легче модифицировать с помощью фоторасщепляемых групп по сравнению с более крупными конструкциями, такими как белки. Фотоактивируемые белки были случайно обнаружены гораздо позже (в 2002 году) благодаря наблюдению, что белок Kaede , оставленный на скамейке под воздействием солнечного света, изменил флуоресценцию на более длинную волну. [4]
Белки , которые чувствуют и реагируют на свет , изначально были выделены из фоторецепторов водорослей , кораллов и других морских организмов. Два наиболее часто используемых фотоактивируемых белка в научных исследованиях по состоянию на 2013 год — это фотоактивируемые флуоресцентные белки и ретинилиденовые белки . Фотоактивируемые флуоресцентные белки изменяют длину волны излучения на большую при освещении УФ-светом. В Kaede это изменение вызвано расщеплением трипептида хромофора His62-Tyr63-Gly64. [5] Это открытие проложило путь для современных методов микроскопии сверхвысокого разрешения, таких как PALM или STORM. Ретинилиденовые белки , такие как каналородопсины или галородопсины , представляют собой светочувствительные катионные и хлоридные каналы , которые открываются при освещении синим и желтым светом соответственно. Этот принцип успешно использовался для управления активностью нейронов в живых клетках и даже тканях и дал начало совершенно новой области исследований — оптогенетике .
Нуклеиновые кислоты играют важную роль в качестве клеточного хранилища информации и механизма регуляции генов . В попытках регулировать этот механизм с помощью света ДНК и РНК были модифицированы фоторасщепляемыми группами на остове (в подходе, называемом «статистическим каркасом остова»; защитные группы реагируют в основном с фосфатными группами остова). В организме модифицированные нуклеиновые кислоты «молчат», и только при облучении светом их активность может быть включена. [6] Этот подход находит применение в биологии развития , где хронология активности генов представляет особый интерес. Каркасные нуклеиновые кислоты позволяют исследователям очень точно включать интересующие гены во время развития целых организмов. [7]
Малые молекулы легко модифицируются химическим синтезом и поэтому были одними из первых, которые были модифицированы и использованы в биологических исследованиях. Существует большое разнообразие малых молекул в клетках.
Фотохимические реакции могут преобразовывать неэмиссионный реагент во флуоресцентный продукт. [8] Эти реакции могут быть использованы в микроскопии сверхвысокого разрешения для локализации за пределами дифракционного предела .
Преимущества активации эффекторов светом (точный контроль, быстрая реакция, высокая специфичность, отсутствие перекрестных реакций) особенно интересны в нейротрансмиттерах. Были синтезированы клеточный дофамин , серотонин , глицин и ГАМК , и их влияние на нейронную активность было тщательно изучено. [9]
Не только аминокислоты , но и ионы могут быть захвачены. Поскольку кальций является мощным клеточным вторичным мессенджером , захваченные варианты были синтезированы с использованием свойств ЭДТА по захвату ионов . Светоиндуцированное расщепление остова ЭДТА приводит к волне свободного кальция внутри клетки. [10]
Другой класс молекул, используемых для передачи сигналов в клетке, — это гормоны . Было показано, что дериваты эстрадиола, находящиеся в клетке , вызывают экспрессию генов при освобождении. Другие зависимые гормоны использовались для изучения взаимодействий рецепторов и лигандов . [11]
Было показано, что липиды участвуют в передаче сигналов . Чтобы проанализировать роли, которые липиды играют в определенных путях, выгодно иметь возможность очень быстро увеличивать концентрацию сигнального липида. Поэтому многие сигнальные липиды также были защищены фотоудаляемыми защитными группами, и было изучено их влияние на клеточную передачу сигналов. Было показано, что клеточный PI3P вызывает слияние эндосом. [12] Клеточный IP3 помог выяснить влияние IP3 на потенциал действия [13] , а клеточный диацилглицерол использовался для определения влияния длины цепи жирных кислот на зависимую от PKC передачу сигналов. [14]
При изучении белок-липидных взаимодействий , другой тип фотоактивации, как оказалось, обеспечивает множество идей. Фотолабильные группы, такие как диазиридины или бензофеноны , которые при УФ-облучении оставляют высокореактивные ионы карбения , могут быть использованы для сшивания интересующего липида с его взаимодействующими белками. Эта методология особенно полезна для проверки существующих и открытия новых белок-липидных взаимодействий. [15]