Осаждение этанолом — это метод, используемый для очистки и/или концентрирования РНК , ДНК и полисахаридов, таких как пектин и ксилоглюкан, из водных растворов путем добавления соли и этанола в качестве антирастворителя.
При экстракции ДНК, после отделения ДНК от других компонентов клетки в воде, ДНК осаждается из раствора путем нейтрализации ее положительно заряженными ионами. Добавление этанола к раствору необходимо для снижения полярности растворителя и обеспечения взаимодействия положительно заряженных ионов с отрицательно заряженными фосфатными группами ДНК.
ДНК обычно отделяется от других компонентов клетки в двухфазном растворе фенола и воды. Из-за своего сильно заряженного фосфатного остова ДНК полярна и будет концентрироваться в водной фазе, тогда как липиды и белки будут концентрироваться в фенольной фазе.
Чтобы осадить ДНК из воды, отрицательно заряженные фосфатные группы остова ДНК нейтрализуются добавлением положительно заряженных ионов из соли. Но из-за высокой полярности воды, иллюстрируемой ее высокой диэлектрической проницаемостью 80,1 (при 20 °C), положительно заряженные ионы экранированы и не могут взаимодействовать с отрицательно заряженными фосфатными группами ДНК и нейтрализовать их. [1]
Это соотношение отражено в законе Кулона , который можно использовать для расчета силы, действующей на два заряда , разделенных расстоянием, используя диэлектрическую проницаемость (также называемую относительной статической проницаемостью) среды в знаменателе уравнения ( — электрическая постоянная ):
На атомном уровне уменьшение силы, действующей на заряд, происходит из-за того, что молекулы воды формируют вокруг него гидратную оболочку . Этот факт делает воду очень хорошим растворителем для заряженных соединений, таких как соли.
Этанол гораздо менее полярен, чем вода, с диэлектрической проницаемостью 24,3 (при 25 °C). Это означает, что добавление этанола в раствор нарушает экранирование зарядов водой. Если добавлено достаточно этанола, электрическое притяжение между фосфатными группами и любыми положительными ионами, присутствующими в растворе, становится достаточно сильным, чтобы образовать стабильные ионные связи, заставляющие ДНК выпадать в осадок из раствора. Обычно это происходит, когда этанол составляет более 64% раствора. Как предполагает механизм, раствор должен содержать положительные ионы для того, чтобы произошло осаждение; обычно эту роль играют Na + , NH 4 + или Li + . [2]
ДНК осаждают, сначала обеспечив правильную концентрацию положительных ионов в растворе (слишком много приведет к большому количеству соли, соосаждающейся с ДНК, слишком мало приведет к неполному восстановлению ДНК), а затем добавляя два-три объема не менее 95% этанола. Многие протоколы рекомендуют хранить ДНК при низкой температуре на этом этапе, но есть также наблюдения, что это может не улучшить восстановление ДНК и даже может снизить эффективность осаждения при использовании времени инкубации в течение ночи. [3] [4] Таким образом, хорошей эффективности можно достичь при комнатной температуре, но если принять во внимание возможную деградацию, вероятно, лучше инкубировать ДНК на мокром льду. Оптимальное время инкубации зависит от длины и концентрации ДНК. Более мелкие фрагменты и более низкие концентрации потребуют более длительного времени для достижения приемлемого восстановления. Для очень малых длин и низких концентраций рекомендуется инкубация в течение ночи. В таких случаях использование носителей, таких как тРНК , гликоген или линейный полиакриламид, может значительно улучшить восстановление.
Во время инкубации ДНК и некоторые соли выпадут в осадок из раствора, на следующем этапе этот осадок собирается центрифугированием в микроцентрифужной пробирке на высоких скоростях (~12 000 g ). Время и скорость центрифугирования оказывают наибольшее влияние на скорость восстановления ДНК. Опять же, более мелкие фрагменты и более высокие разбавления требуют более длительного и быстрого центрифугирования. Центрифугирование можно проводить как при комнатной температуре, так и при 4 °C или 0 °C. Во время центрифугирования осажденная ДНК должна пройти через раствор этанола на дно пробирки, более низкие температуры увеличивают вязкость раствора, а большие объемы увеличивают расстояние, поэтому оба эти фактора снижают эффективность этого процесса, требуя более длительного центрифугирования для того же эффекта. [3] [4] После центрифугирования раствор супернатанта удаляется, оставляя осадок сырой ДНК. Видимость осадка зависит от количества ДНК и его чистоты (более грязные осадки легче увидеть) или от использования сопреципитатов.
На следующем этапе к осадку добавляется 70% этанола, и он осторожно перемешивается, чтобы разбить осадок и промыть его. Это удаляет часть солей, присутствующих в оставшемся супернатанте и связанных с осадком ДНК, делая окончательный очиститель ДНК. Эту суспензию снова центрифугируют, чтобы снова осадить ДНК, и раствор супернатанта удаляется. Этот шаг повторяется один раз.
Наконец, осадок высушивают на воздухе, а ДНК ресуспендируют в воде или другом желаемом буфере . Важно не пересушить осадок, так как это может привести к денатурации ДНК и затруднить ее ресуспендирование.
Вместо этанола можно использовать также изопропанол ; эффективность осаждения изопропанола выше, что делает один объем достаточным для осаждения. Однако изопропанол менее летуч, чем этанол, и требует больше времени для высыхания на воздухе на последнем этапе. Осадок также может менее плотно прилипать к трубке при использовании изопропанола. [2]
