Колоночная хроматография в химии — это метод хроматографии , используемый для выделения одного химического соединения из смеси. Хроматография способна разделять вещества на основе дифференциальной абсорбции соединений адсорбентом; соединения перемещаются через колонку с разной скоростью, что позволяет разделять их на фракции. Метод широко применяется, так как можно использовать множество различных адсорбентов (нормальная фаза, обращенная фаза или иные) с широким спектром растворителей. Метод можно использовать в масштабах от микрограммов до килограммов. Основным преимуществом колоночной хроматографии является относительно низкая стоимость и одноразовость неподвижной фазы, используемой в процессе. Последнее предотвращает перекрестное загрязнение и деградацию неподвижной фазы из-за рециркуляции. Колоночную хроматографию можно проводить с использованием гравитации для перемещения растворителя или с использованием сжатого газа для проталкивания растворителя через колонку.
Тонкослойный хроматограф может показать, как смесь соединений будет вести себя при очистке с помощью колоночной хроматографии. Разделение сначала оптимизируется с помощью тонкослойной хроматографии, а затем выполняется колоночная хроматография.
Колонка готовится путем упаковки твердого адсорбента в цилиндрическую стеклянную или пластиковую трубку. Размер будет зависеть от количества изолируемого соединения. В основании трубки находится фильтр, либо ватный тампон, либо стеклянная вата, либо стеклянная фритта для удержания твердой фазы на месте. Резервуар для растворителя может быть прикреплен к верхней части колонки.
Обычно для подготовки колонки используются два метода: сухой метод и мокрый метод. При сухом методе колонка сначала заполняется сухим порошком неподвижной фазы, затем добавляется подвижная фаза, которая промывается через колонку до тех пор, пока она не станет полностью влажной, и с этого момента ей никогда не позволяют высохнуть. [1] При мокром методе готовится суспензия элюента с порошком неподвижной фазы, а затем осторожно заливается в колонку. Верхняя часть силикагеля должна быть плоской, а верхняя часть силикагеля может быть защищена слоем песка. Элюент медленно пропускается через колонку для продвижения органического материала.
Отдельные компоненты удерживаются неподвижной фазой по-разному и отделены друг от друга, пока они проходят с разной скоростью через колонку с элюентом. В конце колонки они элюируются по одному за раз. В течение всего процесса хроматографии элюент собирается в ряд фракций . Фракции могут собираться автоматически с помощью коллекторов фракций. Производительность хроматографии может быть увеличена за счет одновременной работы нескольких колонок. В этом случае используются многопоточные коллекторы. Состав потока элюента можно контролировать, и каждая фракция анализируется на наличие растворенных соединений, например, с помощью аналитической хроматографии, УФ-спектров поглощения или флуоресценции . Окрашенные соединения (или флуоресцентные соединения с помощью УФ-лампы) можно увидеть через стеклянную стенку в виде движущихся полос.
Неподвижная фаза или адсорбент в колоночной хроматографии — это твердое вещество. Наиболее распространенной неподвижной фазой для колоночной хроматографии является силикагель , следующим по распространенности является оксид алюминия . В прошлом часто использовался порошок целлюлозы . Для проведения ионообменной хроматографии , обращенно-фазовой хроматографии (RP), аффинной хроматографии или адсорбции в расширенном слое (EBA) доступен широкий спектр неподвижных фаз. Неподвижные фазы обычно представляют собой тонко измельченные порошки или гели и/или являются микропористыми для увеличения поверхности, хотя в EBA используется псевдоожиженный слой. Существует важное соотношение между массой неподвижной фазы и сухой массой смеси аналитов, которая может быть нанесена на колонку. Для колоночной хроматографии на силикагеле это соотношение лежит в пределах от 20:1 до 100:1, в зависимости от того, насколько близко друг к другу элюируются компоненты аналита. [2]
Подвижная фаза или элюент представляет собой растворитель или смесь растворителей, используемых для перемещения соединений через колонку. Он выбирается таким образом, чтобы значение фактора удерживания интересующего соединения составляло примерно около 0,2–0,3, чтобы минимизировать время и количество элюента для проведения хроматографии. Элюент также выбирается таким образом, чтобы можно было эффективно разделить различные соединения. Элюент оптимизируется в ходе небольших предварительных испытаний, часто с использованием тонкослойной хроматографии (ТСХ) с той же неподвижной фазой, используя растворители различной полярности, пока не будет найдена подходящая система растворителей. Обычные растворители подвижной фазы, в порядке возрастания полярности, включают гексан , дихлорметан , этилацетат , ацетон и метанол . [3] Обычный растворитель представляет собой смесь гексана и этилацетата с пропорциями, отрегулированными до тех пор, пока целевое соединение не будет иметь фактор удерживания 0,2–0,3. Вопреки распространенному заблуждению, метанол сам по себе может использоваться в качестве элюента для высокополярных соединений и не растворяет силикагель.
Существует оптимальная скорость потока для каждого конкретного разделения. Более высокая скорость потока элюента минимизирует время, необходимое для работы колонки, и тем самым минимизирует диффузию, что приводит к лучшему разделению. Однако максимальная скорость потока ограничена, поскольку для уравновешивания аналита между неподвижной и подвижной фазами требуется конечное время, см. уравнение Ван-Деемтера . Простая лабораторная колонка работает под действием силы тяжести . Скорость потока такой колонки можно увеличить, выдвинув заполненную свежим элюентом колонку выше верхней части неподвижной фазы, или уменьшить с помощью кранов. Более высокие скорости потока можно достичь, используя насос или сжатый газ (например, воздух, азот или аргон ) для проталкивания растворителя через колонку (флэш-колоночная хроматография). [4] [5]
Размер частиц неподвижной фазы обычно мельче в колоночной флэш-хроматографии, чем в гравитационной колоночной хроматографии. Например, одним из наиболее широко используемых сортов силикагеля в первой технике является сетка 230–400 (40–63 мкм), тогда как для второй техники обычно требуется силикагель сетка 70–230 (63–200 мкм). [6]
Разработана электронная таблица, которая помогает в успешной разработке флэш-колонок. Электронная таблица оценивает объем удерживания и объем полосы аналитов, ожидаемые числа фракций, которые содержат каждый аналит, и разрешение между соседними пиками. Эта информация позволяет пользователям выбирать оптимальные параметры для препаративного разделения до того, как будет использована сама флэш-колонка. [7]
Колоночная хроматография является чрезвычайно трудоемким этапом в любой лаборатории и может быстро стать узким местом для любой технологической лаборатории. Многие производители, такие как Biotage, Buchi, Interchim и Teledyne Isco, разработали автоматизированные системы флэш-хроматографии (обычно называемые LPLC, жидкостная хроматография низкого давления, около 350–525 кПа или 50,8–76,1 фунтов на кв. дюйм), которые сводят к минимуму участие человека в процессе очистки. Автоматизированные системы будут включать компоненты, обычно встречающиеся в более дорогих системах высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), такие как градиентный насос, порты для ввода образцов, УФ-детектор и коллектор фракций для сбора элюента. Обычно эти автоматизированные системы могут разделять образцы от нескольких миллиграммов до промышленных многокилограммовых масштабов и предлагают гораздо более дешевое и быстрое решение для выполнения множественных вводов в системах препаративной ВЭЖХ.
Разрешение (или способность разделять смесь) в системе LPLC всегда будет ниже по сравнению с HPLC, так как наполнитель в колонке HPLC может быть намного меньше, обычно всего 5 микрометров, что увеличивает площадь поверхности неподвижной фазы, увеличивает поверхностные взаимодействия и обеспечивает лучшее разделение. Однако использование этого небольшого наполнительного материала вызывает высокое обратное давление, и поэтому это называется жидкостной хроматографией высокого давления. Колонки LPLC обычно заполнены силикагелем размером около 50 микрометров, что снижает обратное давление и разрешение, но также устраняет необходимость в дорогих насосах высокого давления. Производители теперь начинают переходить на системы флэш-хроматографии более высокого давления и назвали их системами жидкостной хроматографии среднего давления (MPLC), которые работают выше 1 МПа (150 фунтов на кв. дюйм).
Обычно колоночная хроматография устанавливается с перистальтическими насосами, текущими буферами и образцом раствора через верхнюю часть колонки. Растворы и буферы проходят через колонку, где коллектор фракций в конце установки колонки собирает элюированные образцы. Перед сбором фракций образцы, которые элюируются из колонки, проходят через детектор, такой как спектрофотометр или масс -спектрометр, так что можно определить концентрацию разделенных образцов в смеси раствора образца.
Например, если бы вам нужно было разделить два разных белка с разной связывающей способностью к колонке из образца раствора, хорошим типом детектора был бы спектрофотометр, использующий длину волны 280 нм. Чем выше концентрация белка, который проходит через элюированный раствор через колонку, тем выше поглощение этой длины волны.
Поскольку колоночная хроматография имеет постоянный поток элюированного раствора, проходящего через детектор с различными концентрациями, детектор должен построить график концентрации элюированного образца с течением времени. Этот график концентрации образца в зависимости от времени называется хроматограммой.
Конечной целью хроматографии является разделение различных компонентов из смеси растворов. Разрешение выражает степень разделения компонентов смеси. Чем выше разрешение хроматограммы, тем лучше степень разделения образцов, которую обеспечивает колонка. Эти данные являются хорошим способом определения разделительных свойств колонки для данного конкретного образца. Разрешение можно рассчитать по хроматограмме.
Отдельные кривые на диаграмме представляют различные профили концентрации элюирования образца с течением времени на основе их сродства к смоле колонки. Для расчета разрешения требуются время удерживания и ширина кривой.
Время удерживания — это время от начала обнаружения сигнала детектором до пиковой высоты профиля концентрации элюирования каждого отдельного образца.
Ширина кривой — это ширина кривой профиля концентрации различных образцов на хроматограмме в единицах времени.
Упрощенный метод расчета разрешения хроматограммы заключается в использовании модели пластины. [8] Модель пластины предполагает, что колонку можно разделить на определенное количество секций или пластин, и баланс масс можно рассчитать для каждой отдельной пластины. Этот подход аппроксимирует типичную кривую хроматограммы как кривую распределения Гаусса . При этом ширина кривой оценивается как 4-кратное стандартное отклонение кривой, 4σ. Время удерживания — это время от начала обнаружения сигнала до времени пиковой высоты кривой Гаусса.
Из переменных, представленных на рисунке выше, можно рассчитать разрешение, количество тарелок и высоту тарелок модели колонной тарелки с помощью уравнений:
Разрешение (R s ):
где:
Номерной знак (N):
Высота пластины (H):
где L — длина колонны. [8]
Для адсорбционной колонки смола колонки (стационарная фаза) состоит из микрошариков. Даже более мелкие частицы, такие как белки, углеводы, ионы металлов или другие химические соединения, конъюгируются с микрошариками. Можно предположить, что каждая связывающая частица, прикрепленная к микрошарику, связывается в соотношении 1:1 с образцом растворенного вещества, отправленным через колонку, который необходимо очистить или разделить.
Связывание между целевой молекулой, которую необходимо разделить, и связывающей молекулой на шариках колонки можно смоделировать с помощью простой равновесной реакции K eq = [CS]/([C][S]), где K eq — константа равновесия , [C] и [S] — концентрации целевой молекулы и связывающей молекулы на смоле колонки соответственно. [CS] — концентрация комплекса целевой молекулы, связанной со смолой колонки. [8]
Используя это в качестве основы, для описания динамики связывания колоночной хроматографии можно использовать три различные изотермы: линейную, Ленгмюра и Фрейндлиха.
Линейная изотерма возникает, когда концентрация растворенного вещества, которую необходимо очистить, очень мала по сравнению с молекулой связывания. Таким образом, равновесие можно определить как:
Для промышленного масштаба необходимо учитывать общее количество связывающих молекул на гранулах смолы колонки, поскольку необходимо учитывать незанятые места. Изотерма Ленгмюра и изотерма Фрейндлиха полезны для описания этого равновесия. Изотерма Ленгмюра определяется как:
Изотерма Фрейндлиха имеет вид:
Изотерма Фрейндлиха используется, когда колонка может связываться со многими различными образцами в растворе, который необходимо очистить. Поскольку многие различные образцы имеют разные константы связывания с шариками, существует много различных K eq s. Поэтому изотерма Ленгмюра не является хорошей моделью для связывания в этом случае. [8]
{{cite book}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка )