фрагментация ДНК

Разделение или разрыв цепей ДНК на части

Фрагментация ДНК — это разделение или разрыв цепей ДНК на части. Это может быть сделано намеренно лабораторным персоналом или клетками, или может произойти спонтанно. Спонтанная или случайная фрагментация ДНК — это фрагментация, которая постепенно накапливается в клетке. Ее можно измерить, например, с помощью анализа Comet или анализа TUNEL .

Его основной единицей измерения является индекс фрагментации ДНК (ИФД). ^[1] ИФД в 20% и более значительно снижает показатели успешности после ИКСИ. ^[1]

Фрагментация ДНК была впервые задокументирована Уильямсоном в 1970 году, когда он наблюдал дискретные олигомерные фрагменты, возникающие во время гибели клеток в первичных неонатальных культурах печени. Он описал цитоплазматическую ДНК, выделенную из клеток печени мышей после культивирования, как характеризующуюся фрагментами ДНК с молекулярной массой , состоящей из кратных 135 кДа . Это открытие согласуется с гипотезой о том, что эти фрагменты ДНК являются специфическим продуктом деградации ядерной ДНК. ^[2]

Преднамеренный

Фрагментация ДНК часто необходима перед созданием библиотеки или субклонированием последовательностей ДНК. При фрагментации ДНК лабораторным персоналом использовались различные методы, включающие механическое разрушение ДНК. К таким методам относятся обработка ультразвуком, сдвиг иглой, распыление, сдвиг с помощью точки погружения и прохождение через ячейку давления. ^[3]

• Рестрикционный гидролиз — это преднамеренное лабораторное разделение цепей ДНК. Это основанная на ферментах обработка, используемая в биотехнологии для разрезания ДНК на более мелкие цепи с целью изучения различий в длине фрагментов у отдельных людей или для клонирования генов. ^[4] Этот метод фрагментирует ДНК либо путем одновременного расщепления обеих цепей, либо путем создания надрезов на каждой цепи dsDNA для получения разрывов dsDNA. ^[5]
• Акустическое смещение передачи высокочастотных акустических энергетических волн, доставленных в библиотеку ДНК. Преобразователь имеет форму чаши, так что волны сходятся в интересующей цели. ^[5]
• Распыление проталкивает ДНК через небольшое отверстие в распылителе , что приводит к образованию мелкодисперсного тумана, который собирается. Размер фрагмента определяется давлением газа, используемого для проталкивания ДНК через распылитель, скоростью, с которой раствор ДНК проходит через отверстие, вязкостью раствора и температурой. ^{[5] [6]}
• Соникация , тип гидродинамического сдвига, подвергает ДНК акустической кавитации и гидродинамическому сдвигу путем воздействия коротких периодов соникации, что обычно приводит к фрагментам размером 700 п.н. Для фрагментации ДНК соникация обычно применяется в циклах всплесков с использованием соникатора зондового типа. ^[7]
• Сдвиг с точечным стоком, тип гидродинамического сдвига, использует шприцевой насос для создания гидродинамических сдвиговых сил, проталкивая библиотеку ДНК через небольшое резкое сокращение. Около 90% длин фрагментов попадают в двукратный диапазон. ^[5]
• Сдвиг иглы создает сдвигающие силы путем пропускания библиотек ДНК через иглу малого калибра. ^[5] ДНК проходит через иглу малого калибра несколько раз, чтобы физически разорвать ДНК на мелкие кусочки.
• Французские пресс-камеры пропускают ДНК через узкий клапан под высоким давлением, чтобы создать высокие сдвиговые усилия. ^[5] С помощью французского пресса сдвиговое усилие можно аккуратно модулировать, регулируя давление поршня. Пресс обеспечивает один проход через точку максимального сдвигового усилия, ограничивая повреждение деликатных биологических структур из-за повторного сдвига, как это происходит в других методах разрушения.
• При транспозомной фрагментации (тагментации) транспозомы готовятся с ДНК, которая затем разрезается таким образом, что события транспозиции приводят к фрагментированной ДНК с адаптерами (вместо вставки). Относительная концентрация транспозом и ДНК должна быть подходящей.

Спонтанный

Апоптотическая фрагментация ДНК — это естественная фрагментация, которую клетки выполняют при апоптозе (запрограммированной гибели клеток). Фрагментация ДНК — это биохимический признак апоптоза. В умирающих клетках ДНК расщепляется эндонуклеазой, которая фрагментирует хроматин на нуклеосомные единицы, которые являются кратными олигомерам размером около 180 п.н. и выглядят как лестница ДНК при прогоне на агарозном геле. [8] Фермент, ответственный за апоптотическую фрагментацию ^ДНК , — это ДНКаза, активируемая каспазой . CAD обычно ингибируется другим белком, ингибитором ДНКазы, активируемой каспазой (ICAD) . Во время апоптоза апоптотическая эффекторная каспаза, каспаза 3, расщепляет ICAD и, таким образом, активирует CAD. ^[9]

Нуклеосома , состоящая из ДНК (серая), обернутой вокруг тетрамера гистонов (цветной). При апоптотической фрагментации ДНК ДНК расщепляется в области межнуклеосомного линкера , которая является частью ДНК, не обернутой вокруг гистонов.

CAD расщепляет ДНК в межнуклеосомных линкерных участках между нуклеосомами, протеинсодержащими структурами, которые встречаются в хроматине с интервалом ~180 п.н. Это происходит потому, что ДНК обычно плотно обернута вокруг гистонов, основных белков нуклеосом. Линкерные участки являются единственными частями цепи ДНК, которые открыты и, таким образом, доступны для CAD.

Мужчины с дефектами подвижности сперматозоидов часто имеют высокий уровень фрагментации ДНК сперматозоидов. ^[10] Степень фрагментации ДНК в сперматозоидах может предсказать результаты экстракорпорального оплодотворения ^[11] (ЭКО) и его расширения интрацитоплазматической инъекции сперматозоида ^[1] (ИКСИ). Тест дисперсии хроматина сперматозоидов (SCD) и анализ TUNEL оба эффективны для обнаружения повреждения ДНК сперматозоидов. ^{[12] [13]} При использовании микроскопии в светлом поле тест SCD, по-видимому, более чувствителен, чем анализ TUNEL. ^[13]

Использует

Фрагментация ДНК играет важную роль в судебной экспертизе, особенно при профилировании ДНК .

• Полиморфизм длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ) — это метод анализа различных длин фрагментов ДНК, которые возникают в результате переваривания образца ДНК эндонуклеазой рестрикции . Эндонуклеаза рестрикции разрезает ДНК по определенному шаблону последовательности, известному как сайт распознавания эндонуклеазы рестрикции. Наличие или отсутствие определенных сайтов распознавания в образце ДНК генерирует различные длины фрагментов ДНК, которые разделяются с помощью гель-электрофореза . Затем они гибридизуются с ДНК-зондами, которые связываются с комплементарной последовательностью ДНК в образце. ^[14]
• В ходе анализа полимеразной цепной реакции (ПЦР) производятся миллионы точных копий ДНК из биологического образца. Он используется для амплификации определенного участка цепи ДНК (целевой ДНК). Большинство методов ПЦР обычно амплифицируют фрагменты ДНК размером от 0,1 до 10 килопар оснований (кб), хотя некоторые методы позволяют амплифицировать фрагменты размером до 40 кб. ^[14] ПЦР также использует тепло для разделения цепей ДНК.
• ДНК, фрагментированная в процессе апоптоза, размером от 1 до 20 нуклеосом, может быть селективно выделена из клеток, фиксированных в денатурирующем фиксаторе этаноле ^[15]

Ссылки

1. Speyer BE, Pizzey AR, Ranieri M, Joshi R, Delhanty JD, Serhal P (май 2010 г.). «Падение показателей имплантации после ИКСИ со спермой с высокой фрагментацией ДНК». Hum Reprod . 25 (7): 1609–1618. doi :10.1093/humrep/deq116. PMID  20495207.
2. Уильямсон, Роберт (1970). «Свойства быстро меченых фрагментов дезоксирибонуклеиновой кислоты, выделенных из цитоплазмы первичных культур эмбриональных клеток печени мыши». Журнал молекулярной биологии . 51 (1): 157–168. doi :10.1016/0022-2836(70)90277-9. PMID  5481278.
3. Куэйл, Майкл Эндрю (2010). «ДНК: Механическое разрушение». Энциклопедия наук о жизни . doi :10.1002/9780470015902.a0005333.pub2. ISBN 978-0470016176.
4. Филлипс, Тереза. "Restriction Enzymes Explained". Биотехнология / Биомедицина . About.com. Архивировано из оригинала 5 июня 2016 года . Получено 2 апреля 2013 года .
5. "DNA Fragmentation". New England Biolabs. Архивировано из оригинала 20 декабря 2016 года . Получено 2 апреля 2013 года .
6. Сэмбрук, Джозеф; Рассел, Дэвид В. (2006). «Фрагментация ДНК с помощью распыления». Cold Spring Harbor Protocols . 2006 (23). Cold Spring Harbor Laboratory Press: pdb.prot4539. doi :10.1101/pdb.prot4539. PMID  22485920. Получено 3 апреля 2013 г.
7. "Ультразвуковой лизис: разрушение клеток и фрагментация экстракции" . Получено 15 мая 2017 г.
8. Nagata S (апрель 2000 г.). «Апоптическая фрагментация ДНК». Exp. Cell Res . 256 (1): 12–8. doi :10.1006/excr.2000.4834. PMID  10739646.
9. Энари, Масато; Сакахира, Хидеки; Ёкояма, Хидеки; Окава, Кацуя; Ивамацу, Акихиро; Нагата Сигеказу (январь 1998 г.). «ДНКаза, активируемая каспазой, которая разрушает ДНК во время апоптоза, и ее ингибитор ICAD». Природа . 391 (6662): 43–50. Бибкод : 1998Natur.391...43E. дои : 10.1038/34112. PMID  9422506. S2CID  4407426 . Проверено 8 апреля 2013 г.
10. Belloc S, Benkhalifa M, Cohen-Bacrie M, Dalleac A, Chahine H, Amar E, Zini A (2014). «Какая изолированная аномалия спермы наиболее связана с повреждением ДНК спермы у мужчин, обращающихся за оценкой бесплодия». J. Assist. Reprod. Genet . 31 (5): 527–32. doi :10.1007/s10815-014-0194-3. PMC 4016368. PMID  24566945 . 
11. Simon L, Brunborg G, Stevenson M, Lutton D, McManus J, Lewis SE (май 2010 г.). «Клиническое значение повреждения ДНК сперматозоидов в результатах вспомогательной репродукции». Hum Reprod . 25 (7): 1594–1608. doi : 10.1093/humrep/deq103 . PMID  20447937.
12. Gorczyca W, Traganos F, Jesionowska H, ​​Darzynkiewicz Z (1993). «Наличие разрывов нитей ДНК и повышенная чувствительность ДНК in situ к денатурации в аномальных человеческих сперматозоидах. Аналогия с апоптозом соматических клеток». Exp Cell Res . 207 (1): 202–205. doi :10.1006/excr.1993.1182. PMID  8391465.{{cite journal}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка )
13. Zhang LH, Qiu Y, Wang KH, Wang Q, Tao G, Wang LG (июнь 2009 г.). «Измерение фрагментации ДНК сперматозоидов с помощью микроскопии в светлом поле: сравнение между тестом дисперсии хроматина сперматозоидов и анализом маркировки концевых уридиновых ник-концов». Fertil. Steril . 94 (3): 1027–1032. doi : 10.1016/j.fertnstert.2009.04.034 . PMID  19505686.
14. "DNA Forensics". Программы генома Министерства энергетики США . Получено 8 апреля 2013 г.
15. Gong JP, Traganos F, Darzynkiewicz Z (1994). «Селективная процедура извлечения ДНК из апоптотических клеток, применимая для гель-электрофореза и проточной цитометрии». Anal Biochem . 218 (2): 314–319. doi :10.1006/abio.1994.1184. PMID  8074286.{{cite journal}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка )