Культура тканей растений — это совокупность методов, используемых для поддержания или выращивания растительных клеток, тканей или органов в стерильных условиях на питательной культуральной среде известного состава. Он широко используется для получения клонов растения методом, известным как микроразмножение . Различные методы культуры тканей растений могут иметь определенные преимущества перед традиционными методами размножения, в том числе:
Культура растительных тканей основана на том факте, что многие части растения обладают способностью регенерировать в целое растение (клетки этих регенерирующих частей растения называются тотипотентными клетками, которые могут дифференцироваться в различные специализированные клетки). Отдельные клетки, растительные клетки без клеточных стенок ( протопласты ), кусочки листьев, стеблей или корней часто можно использовать для создания нового растения на питательной среде с учетом необходимых питательных веществ и растительных гормонов .
Подготовку растительной ткани к культуре тканей проводят в асептических условиях на воздухе, фильтрованном HEPA , в камере с ламинарным потоком . После этого ткань выращивают в стерильных контейнерах, таких как чашки Петри или колбы, в камере для выращивания с контролируемой температурой и интенсивностью света. Живые растительные материалы из окружающей среды естественным образом загрязняются на своих поверхностях (а иногда и внутри) микроорганизмами , поэтому их поверхности стерилизуются в химических растворах (обычно спирте и гипохлорите натрия или кальция ) [1] перед тем, как отбирать подходящие образцы (известные как экспланты ). . Затем стерильные эксплантаты обычно помещают на поверхность стерильной твердой культуральной среды, но иногда помещают непосредственно в стерильную жидкую среду, особенно когда желательны культуры суспензии клеток. Твердые и жидкие среды обычно состоят из неорганических солей, а также небольшого количества органических питательных веществ, витаминов и растительных гормонов. Твердые среды готовят из жидких сред с добавлением желирующего агента, обычно очищенного агара .
Состав среды, особенно растительные гормоны и источник азота (нитрат или соли аммония или аминокислоты), оказывают глубокое влияние на морфологию тканей, которые растут из исходного эксплантата. Например, избыток ауксина часто приводит к разрастанию корней, а избыток цитокинина может привести к образованию побегов . Баланс ауксина и цитокинина часто приводит к неорганизованному росту клеток или каллюсу , но морфология выроста будет зависеть от вида растения, а также от состава среды. По мере роста культуры ее кусочки обычно отрезают и пересевают на новую среду, чтобы обеспечить рост или изменить морфологию культуры. Навыки и опыт специалиста по культивированию тканей важны для принятия решения о том, какие части культивировать, а какие выбросить.
Когда из культуры появляются побеги, их можно срезать и укоренить с помощью ауксина, чтобы получить ростки, которые, когда они созреют, можно перенести в горшечную почву для дальнейшего роста в теплице как нормальные растения. [2]
Конкретные различия в регенерационном потенциале разных органов и эксплантов имеют разные объяснения. К значимым факторам относятся различия в стадиях клеточного цикла , наличие или способность транспортировать эндогенные регуляторы роста, а также метаболические возможности клеток. Наиболее часто используемые тканевые эксплантаты представляют собой меристематические концы растений, такие как кончик стебля, кончик пазушной почки и кончик корня. [3] Эти ткани имеют высокую скорость деления клеток и либо концентрируют, либо производят необходимые вещества, регулирующие рост, включая ауксины и цитокинины.
Эффективность регенерации побегов в культуре тканей обычно является количественным признаком , который часто варьируется между видами растений и внутри вида растений в зависимости от подвидов, сортов, сортов или экотипов . Следовательно, регенерация культуры ткани может усложниться, особенно когда необходимо разработать множество процедур регенерации для разных генотипов одного и того же вида.
Тремя распространенными путями регенерации культуры тканей растений являются размножение из ранее существовавших меристем (культура побегов или узловая культура), органогенез и незиготический эмбриогенез .
Размножение побегами или узловыми сегментами обычно осуществляется в четыре этапа для массового получения проростков путем вегетативного размножения in vitro, но органогенез - это стандартный метод микроразмножения, который включает регенерацию тканей адвентивных органов или пазушных почек прямо или косвенно из эксплантов. Незиготический эмбриогенез представляет собой заслуживающий внимания путь развития, который во многом сопоставим с путем развития зиготических эмбрионов, и является важным путем для производства сомаклональных вариантов, разработки искусственных семян и синтеза метаболитов. Из-за одноклеточного происхождения незиготных эмбрионов они предпочтительны в некоторых системах регенерации для микроразмножения, манипуляций с плоидностью, переноса генов и производства синтетических семян. Тем не менее, регенерация тканей посредством органогенеза также оказалась полезной для изучения регуляторных механизмов развития растений.
Ткань, полученная из растения, подлежащего культивированию, называется эксплантатом.
Экспланты могут быть взяты из самых разных частей растения, включая части побегов, листьев, стеблей, цветков, корней, отдельных недифференцированных клеток , а также из многих типов зрелых клеток при условии, что они все еще содержат живую цитоплазму и ядра и способны деградировать. дифференцировать и возобновлять деление клеток. Это привело к появлению концепции тотипотентности растительных клеток. [4] [5] Однако это верно не для всех клеток и не для всех растений. [6] У многих видов эксплантаты различных органов различаются по скорости роста и регенерации, а некоторые вообще не растут. Выбор материала эксплантата также определяет, будут ли проростки, полученные с помощью культуры ткани, гаплоидными или диплоидными . Кроме того, риск микробного заражения увеличивается при использовании неподходящих эксплантов.
Первый метод, включающий меристемы и индукцию множественных побегов, является предпочтительным методом для индустрии микроразмножения, поскольку риски сомаклональных вариаций (генетических вариаций, вызванных культурой ткани) минимальны по сравнению с двумя другими методами. Соматический эмбриогенез - это метод, который потенциально может в несколько раз повысить скорость размножения и пригоден для использования в системах жидких культур, таких как биореакторы.
Некоторые экспланты, например кончик корня , трудно изолировать, и они загрязнены почвенной микрофлорой, что становится проблематичным в процессе культивирования тканей. Определенная почвенная микрофлора может образовывать тесные связи с корневой системой или даже расти внутри корня. Частицы почвы, связанные с корнями, трудно удалить без повреждения корней, что в свою очередь приводит к микробной атаке. Эта связанная микрофлора обычно перерастает среду тканевой культуры до того, как произойдет значительный рост растительной ткани.
Некоторые культивируемые ткани растут медленно. Для них было бы два варианта: (i) оптимизация культуральной среды; (ii) Культивирование высокочувствительных тканей или сортов. [7] Некроз может испортить культивируемые ткани. В целом сорта растений различаются по восприимчивости к некрозу тканевых культур. Таким образом, с этим можно справиться путем культивирования высокочувствительных сортов (или тканей). [7]
Воздушные (надпочвенные) экспланты также богаты нежелательной микрофлорой. Однако их легче удалить из эксплантата путем осторожного промывания, а остатки обычно можно уничтожить поверхностной стерилизацией. Большая часть поверхностной микрофлоры не образует прочных связей с растительной тканью . Такие ассоциации обычно можно обнаружить при визуальном осмотре в виде мозаики, обесцвечивания или локализованного некроза на поверхности эксплантата.
Альтернативой получения незагрязненных эксплантов является получение эксплантов из проростков, выращенных в асептических условиях из стерилизованных на поверхности семян. Твердая поверхность семян менее проницаема для проникновения агрессивных поверхностных стерилизующих агентов, например гипохлорита , поэтому приемлемые условия стерилизации, применяемые для семян, могут быть гораздо более жесткими, чем для вегетативных тканей.
Растения, культивируемые в тканях, представляют собой клоны . Если исходное материнское растение, использованное для производства первых эксплантов, восприимчиво к патогену или условиям окружающей среды, то весь урожай будет подвержен той же проблеме. И наоборот, любые положительные черты также останутся в пределах этой линии.
Культура тканей растений широко используется в растениеводстве, лесном хозяйстве и садоводстве. Приложения включают в себя:
Развитие сомаклональной вариации
Климатическая устойчивость
- Как в Кавери Вамане (от NRCB, Тамилнад), банановом мутанте тканевой культуры, способном выдерживать проливные дожди. [14]
Производство вторичных метаболитов
- Такие как кофеин из арабского кофе , никотин из Nicotiana Rustica .
Индукция цветения
- На деревьях с задержкой цветения или на бамбуке , где некоторые виды цветут один раз в жизни, но могут жить дольше 50 лет. [15]
Примечания
Источники
