stringtranslate.com

β-галактозидаза

β-Галактозидаза (EC 3.2.1.23, бета-гал или β-гал ; систематическое название β- D -галактозидгалактогидролаза ) — фермент гликозидгидролаза , катализирующий гидролиз терминальных невосстанавливающих остатков β- D -галактозы в β- D -галактозидах. (Этот фермент расщепляет многие β-галактозиды, а не только лактозу. Иногда его свободно называют лактазой , но это название обычно зарезервировано для пищеварительных ферментов млекопитающих, которые расщепляют именно лактозу.)

β-Галактозиды включают углеводы, содержащие галактозу , где гликозидная связь лежит над молекулой галактозы. Субстраты различных β-галактозидаз включают ганглиозид GM1, лактозилцерамиды, лактозу и различные гликопротеины . [1]

Функция

β-Галактозидаза — это экзогликозидаза , которая гидролизует β -гликозидную связь, образованную между галактозой и ее органической частью. Она также может расщеплять фукозиды и арабинозиды , но с гораздо меньшей скоростью. Это важный фермент в организме человека. Дефицит белка может привести к галактосиалидозу или синдрому Моркио B. В E. coli ген lacZ является структурным геном β-галактозидазы; который присутствует как часть индуцируемой системы lac оперона , который активируется в присутствии лактозы , когда уровень глюкозы низкий. Синтез β-галактозидазы останавливается, когда уровень глюкозы достаточен. [2]

β-Галактозидаза имеет много гомологов , основанных на схожих последовательностях. Некоторые из них эволюционировали как β-галактозидаза (EBG), β-глюкозидаза , 6-фосфо-β-галактозидаза, β-маннозидаза и лактаза-флоризингидролаза. Хотя они могут быть структурно схожи, все они имеют разные функции. [3] Бета-гал ингибируется L -рибозой и конкурентными ингибиторами 2-фенилэтил 1-тио-β- D -галактопиранозидом (PETG), D -галактонолактоном, изопропилтио-β- D -галактозидом (IPTG) и галактозой. [4]

β-галактозидаза важна для организмов, поскольку она является ключевым поставщиком в производстве энергии и источником углерода посредством расщепления лактозы на галактозу и глюкозу. Она также важна для людей с непереносимостью лактозы , поскольку она отвечает за производство безлактозного молока и других молочных продуктов. У многих взрослых людей отсутствует фермент лактаза , который имеет ту же функцию, что и β-галактозидаза, поэтому они не могут должным образом переваривать молочные продукты. β-галактоза используется в таких молочных продуктах, как йогурт, сметана и некоторые сыры, которые обрабатываются ферментом для расщепления любой лактозы перед употреблением человеком. В последние годы β-галактозидаза исследовалась как потенциальное лечение непереносимости лактозы с помощью заместительной генной терапии, при которой ее можно было бы поместить в ДНК человека, чтобы люди могли расщеплять лактозу самостоятельно. [5] [6]

Структура

1023 аминокислоты β-галактозидазы E. coli были секвенированы в 1983 году [7] , а ее структура была определена одиннадцатью годами позже, в 1994 году. Белок представляет собой гомотетрамер массой 464 кДа с 2,2,2-точечной симметрией . [8] Каждая единица β-галактозидазы состоит из пяти доменов ; домен 1 представляет собой β-бочку типа рулета с желе , домены 2 и 4 представляют собой бочонки, подобные фибронектину III типа , домен 5 представляет собой новый β-сэндвич, в то время как центральный домен 3 представляет собой искаженную бочку типа TIM , в которой отсутствует пятая спираль с искажением в шестой цепи. [8]

Третий домен содержит активный сайт. [9] Активный сайт состоит из элементов из двух субъединиц тетрамера, и диссоциация тетрамера на димеры удаляет критические элементы активного сайта. Аминоконцевая последовательность β-галактозидазы, α-пептида, участвующего в α-комплементации, участвует в интерфейсе субъединицы. Ее остатки 22–31 помогают стабилизировать четырехспиральный пучок, который образует основную часть этого интерфейса, а остатки 13 и 15 также вносят вклад в активирующий интерфейс. [ необходима цитата ] Эти структурные особенности дают обоснование феномену α-комплементации, где удаление аминоконцевого сегмента приводит к образованию неактивного димера.

Реакция

реакция β-галактозидазы

β-галактозидаза может катализировать три различные реакции в организмах. В одном из них она может проходить через процесс, называемый трансгалактозилированием, чтобы сделать аллолактозу , создавая положительную обратную связь для производства β-галактозы. Аллолактоза также может расщепляться с образованием моносахаридов. Она также может гидролизовать лактозу в галактозу и глюкозу , которые перейдут в гликолиз . [3] Активный центр β-галактозидазы катализирует гидролиз своего дисахаридного субстрата через «поверхностное» (непродуктивное место) и «глубокое» (продуктивное место) связывание. Галактозиды, такие как PETG и IPTG, будут связываться в поверхностном месте, когда фермент находится в «открытой» конформации, в то время как аналоги переходного состояния, такие как L -рибоза и D -галактонолактон, будут связываться в глубоком месте, когда конформация «закрыта». [4]

Ферментативная реакция состоит из двух химических этапов: галактозилирования и дегалактозилирования. Галактозилирование является первым химическим этапом реакции, на котором Glu461 отдает протон гликозидному кислороду, в результате чего галактоза ковалентно связывается с Glu537. На втором этапе, дегалактозилировании, ковалентная связь разрывается, когда Glu461 принимает протон, заменяя галактозу водой. В ходе реакции в глубоком центре фермента возникают два переходных состояния , по одному после каждого этапа. Когда в реакции участвует вода, образуется галактоза, в противном случае, когда D -глюкоза действует как акцептор на втором этапе, происходит трансгалактозилирование. [4] Кинетически измерено, что отдельные тетрамеры белка катализируют реакции со скоростью 38 500 ± 900 реакций в минуту. [10] Для оптимальной активности фермента требуются одновалентные ионы калия (K + ), а также двухвалентные ионы магния (Mg 2+ ). β-связь субстрата расщепляется терминальной карбоксильной группой на боковой цепи глутаминовой кислоты .

Изображение слева представляет собой ленточную диаграмму бета-галактозидазы, показывающую расположение Glu 461, Glu 537 и Gly 794. Изображение справа представляет собой увеличенную версию, показывающую взаимодействие между аминокислотами.

В E. coli Glu-461 считался нуклеофилом в реакции замещения . [11] Однако теперь известно, что Glu-461 является кислотным катализатором. Вместо этого Glu-537 является фактическим нуклеофилом, [12] связывающимся с галактозильным промежуточным продуктом. У людей нуклеофилом реакции гидролиза является Glu-268. [13] Gly794 важен для активности β-галактозидазы. Он отвечает за приведение фермента в «закрытую», связанную с лигандом, конформацию или « открытую» конформацию, действуя как «шарнир» для петли активного центра. Различные конформации гарантируют, что в активном центре происходит только предпочтительное связывание. В присутствии медленного субстрата активность Gly794 увеличивается, а также увеличивается галактозилирование и уменьшается дегалактозилирование. [4]

Приложения

Анализ β-галактозидазы часто используется в генетике , молекулярной биологии и других науках о жизни . [14] Активный фермент может быть обнаружен с использованием искусственного хромогенного субстрата 5-бром-4-хлор-3-индолил-β- D -галактопиранозида, X-gal . β-галактозидаза расщепляет гликозидную связь в X-gal и образует галактозу и 5-бром-4-хлор-3-гидроксииндол, который димеризуется и окисляется до 5,5'-дибром-4,4'-дихлор-индиго, интенсивного синего продукта, который легко идентифицировать и количественно определить. [15] Он используется, например, в сине-белом экране . [16] Его выработка может быть вызвана негидролизуемым аналогом аллолактозы , IPTG , который связывает и высвобождает lac-репрессор из lac - оператора, тем самым позволяя инициировать транскрипцию.

Он обычно используется в молекулярной биологии в качестве репортерного маркера для мониторинга экспрессии генов. Он также демонстрирует явление, называемое α-комплементацией, которое составляет основу сине-белого скрининга рекомбинантных клонов. Этот фермент может быть разделен на два пептида, LacZ α и LacZ Ω , ни один из которых не активен сам по себе, но когда оба присутствуют вместе, спонтанно собираются в функциональный фермент. Это свойство используется во многих векторах клонирования , где присутствие гена lacZα в плазмиде может дополнять in trans другой мутантный ген, кодирующий LacZΩ в определенных лабораторных штаммах E. coli . Однако, когда фрагменты ДНК вставляются в вектор, продукция LacZα нарушается, поэтому клетки не проявляют активности β-галактозидазы. Наличие или отсутствие активной β-галактозидазы может быть обнаружено с помощью X-gal , который производит характерный синий краситель при расщеплении β-галактозидазой, тем самым предоставляя простой способ отличить наличие или отсутствие клонированного продукта в плазмиде. В исследованиях хромосомных транслокаций лейкемии Добсон и его коллеги использовали белок слияния LacZ у мышей [17] , используя тенденцию β-галактозидазы к олигомеризации, чтобы предположить потенциальную роль олигомерности в функции белка слияния MLL. [18]

Недавнее исследование, проведенное в 2020–2021 годах, определило, что активность бета-галактозидазы коррелирует со старением клеток. Старение клеток можно интерпретировать как клетки, которые не делятся, но клетки, которые не умирают. Активность бета-галактозидазы может быть сверхэкспрессирована, и это может привести к различным заболеваниям, поражающим широкий спектр систем организма. Эти системы включают сердечно-сосудистую систему, скелетную систему и многие другие. Обнаружение стареющих клеток может быть достигнуто путем измерения активности лизосомальной бета-галактозидазы. [19]

Новая изоформа бета-галактозидазы с оптимальной активностью при pH 6,0 (Senescence Associated beta-gal или SA-beta-gal ) [20] , которая специфически экспрессируется при старении (необратимой остановке роста клеток). Для ее обнаружения даже были разработаны специальные количественные анализы. [21] [15] [22] Однако теперь известно, что это происходит из-за сверхэкспрессии и накопления лизосомальной эндогенной бета-галактозидазы, [23] и ее экспрессия не требуется для старения. Тем не менее, она остается наиболее широко используемым биомаркером для стареющих и сенесцентных клеток, поскольку она надежна и легко обнаруживается.

Эволюция

Некоторые виды бактерий, включая E. coli , имеют дополнительные гены β-галактозидазы. Второй ген, называемый эволюционировавшим геном β-галактозидазы ( ebgA ), был обнаружен, когда штаммы с удаленным геном lacZ (но все еще содержащие ген галактозидпермеазы, lacY ), были высеяны на среду, содержащую лактозу (или другие 3-галактозиды) в качестве единственного источника углерода. Через некоторое время некоторые колонии начали расти. Однако белок EbgA является неэффективной лактазой и не допускает роста на лактозе. Два класса одиночных точечных мутаций значительно улучшают активность фермента ebg по отношению к лактозе. [24] [25] и, как следствие, мутантный фермент способен заменить β-галактозидазу lacZ. [26] EbgA и LacZ на 50% идентичны на уровне ДНК и на 33% идентичны на уровне аминокислот. [27] Активный фермент ebg представляет собой совокупность продуктов гена ebgA и гена ebgC в соотношении 1:1, при этом активная форма ферментов ebg представляет собой гетерооктамер α 4 β4. [ 28]

Распространение видов

Большая часть работы, проделанной по β-галактозидазе, получена из E. coli. Однако этот фермент можно найти во многих растениях (особенно фруктах), млекопитающих, дрожжах, бактериях и грибах. [29] Гены β-галактозидазы могут различаться по длине кодирующей последовательности и длине белков, образованных аминокислотами. [30] Это разделяет β-галактозидазы на четыре семейства: GHF-1, GHF-2, GHF-35 и GHF-42. [31] E. Coli принадлежит к GHF-2, все растения принадлежат к GHF-35, а Thermus thermophilus принадлежит к GHF-42. [31] [30] Различные фрукты могут экспрессировать несколько генов β-галактозидазы. Существует по крайней мере семь генов β-галактозидазы, экспрессируемых в развитии плодов томата, которые имеют сходство аминокислот от 33% до 79%. [32] Исследование, направленное на выявление размягчения плодов персиков, обнаружило 17 различных экспрессий генов β-галактозидаз. [30] Единственная другая известная кристаллическая структура β-галактозидазы получена из Thermus thermophilus . [31]

Ссылки

  1. ↑ Иллюстрированный медицинский словарь Дорланда. Архивировано из оригинала 2006-10-16 . Получено 2006-10-22 .
  2. ^ Гарретт Р. (2013). Биохимия . Белмонт, Калифорния: Cengage Learning. стр. 1001. ISBN 978-1133106296.
  3. ^ ab "Гликозидгидролаза, семейство 1, β-глюкозидаза (IPR017736) < InterPro < EMBL-EBI". www.ebi.ac.uk . Получено 11.12.2015 .
  4. ^ abcd Juers DH, Hakda S, Matthews BW, Huber RE (ноябрь 2003 г.). «Структурная основа измененной активности вариантов Gly794 β-галактозидазы Escherichia coli ». Биохимия . 42 (46): 13505–11. дои : 10.1021/bi035506j. ПМИД  14621996.
  5. ^ Salehi S, Eckley L, Sawyer GJ, Zhang X, Dong X, Freund JN, Fabre JW (январь 2009 г.). «Кишечная лактаза как аутологичный репортерный ген β-галактозидазы для исследований экспрессии генов in vivo». Human Gene Therapy . 20 (1): 21–30. doi :10.1089/hum.2008.101. PMID  20377368.
  6. ^ Исикава К., Катаока М., Янамото Т., Накабаяши М., Ватанабэ М., Исихара С., Ямагути С. (июль 2015 г.). «Кристаллическая структура β-галактозидазы из Bacillus circulans ATCC 31382 (BgaD) и конструирование термофильных мутантов». Журнал ФЭБС . 282 (13): 2540–52. дои : 10.1111/февраль 13298 . PMID  25879162. S2CID  33928719.
  7. ^ Калниньш А., Отто К., Рютер У., Мюллер-Хилл Б. (1983). «Последовательность гена lacZ Escherichia coli». Журнал EMBO . 2 (4): 593–7. doi :10.1002/j.1460-2075.1983.tb01468.x. PMC 555066. PMID  6313347 . 
  8. ^ ab Jacobson RH, Zhang XJ, DuBose RF, Matthews BW (июнь 1994). "Трехмерная структура β-галактозидазы из E. coli ". Nature . 369 (6483): 761–6. Bibcode : 1994Natur.369..761J. doi : 10.1038/369761a0. PMID  8008071. S2CID  4241867.
  9. ^ Мэтьюз BW (июнь 2005 г.). «Строение β-галактозидазы E. coli». Comptes Rendus Biologies . 328 (6): 549–56. doi :10.1016/j.crvi.2005.03.006. ПМИД  15950161.
  10. ^ Juers DH, Matthews BW, Huber RE (декабрь 2012 г.). «LacZ β-галактозидаза: структура и функция фермента исторического и молекулярно-биологического значения». Protein Science . 21 (12): 1792–807. doi :10.1002/pro.2165. PMC 3575911 . PMID  23011886. 
  11. ^ Gebler JC, Aebersold R, Withers SG (июнь 1992 г.). «Glu-537, а не Glu-461, является нуклеофилом в активном центре (lac Z) β-галактозидазы из Escherichia coli». Журнал биологической химии . 267 (16): 11126–30. doi : 10.1016/S0021-9258(19)49884-0 . PMID  1350782.
  12. ^ Юань Дж., Мартинес-Бильбао М., Хубер Р. Э. (апрель 1994 г.). «Замены Glu-537 β-галактозидазы из Escherichia coli вызывают значительное снижение каталитической активности». Биохимический журнал . 299 (ч. 2): 527–31. doi :10.1042/bj2990527. PMC 1138303. PMID  7909660 . 
  13. ^ McCarter JD, Burgoyne DL, Miao S, Zhang S, Callahan JW, Withers SG (январь 1997 г.). «Идентификация Glu-268 как каталитического нуклеофила предшественника лизосомальной β-галактозидазы человека методом масс-спектрометрии» (PDF) . Журнал биологической химии . 272 ​​(1): 396–400. doi : 10.1074/jbc.272.1.396 . PMID  8995274. S2CID  35101194.
  14. ^ Ninfa AJ, Ballou DP (2009). Фундаментальные лабораторные подходы к биохимии и биотехнологии . ISBN 978-0-470-47131-9.
  15. ^ ab Gary RK, Kindell SM (август 2005 г.). «Количественный анализ активности бета-галактозидазы, связанной со старением, в экстрактах клеток млекопитающих». Аналитическая биохимия . 343 (2): 329–34. doi :10.1016/j.ab.2005.06.003. PMID  16004951.
  16. ^ Анализ β-галактозидазы (улучшенный Миллер) - OpenWetWare
  17. ^ Dobson CL, Warren AJ, Pannell R, Forster A, Rabbitts TH (март 2000 г.). «Опухолеобразование у мышей со слиянием онкогена лейкемии Mll и бактериального гена lacZ». The EMBO Journal . 19 (5): 843–51. doi :10.1093/emboj/19.5.843. PMC 305624. PMID  10698926 . 
  18. ^ Кривцов АВ, Армстронг СА (ноябрь 2007 г.). «Транслокации MLL, модификации гистонов и развитие стволовых клеток лейкемии». Nature Reviews. Cancer . 7 (11): 823–33. doi :10.1038/nrc2253. PMID  17957188. S2CID  9183717.
  19. ^ Лозано-Торрес, Беатрис; Бландез, Хуан Ф.; Сансенон, Феликс; Мартинес-Маньес, Рамон (апрель 2021 г.). «Хромофлуорогенные зонды для обнаружения β-галактозидазы». Аналитическая и биоаналитическая химия . 413 (9): 2361–2388. дои : 10.1007/s00216-020-03111-8. hdl : 10251/180327 . ISSN  1618-2642. PMID  33606064. S2CID  231957317.
  20. ^ Dimri GP, Lee X, Basile G, Acosta M, Scott G, Roskelley C и др. (сентябрь 1995 г.). «Биомаркер, который идентифицирует стареющие клетки человека в культуре и в стареющей коже in vivo». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 92 (20): 9363–7. Bibcode : 1995PNAS ...92.9363D. doi : 10.1073/pnas.92.20.9363 . PMC 40985. PMID  7568133. 
  21. ^ Bassaneze V, Miyakawa AA, Krieger JE (январь 2008). «Количественный хемилюминесцентный метод изучения репликативного и стресс-индуцированного преждевременного старения в клеточных культурах». Аналитическая биохимия . 372 (2): 198–203. doi :10.1016/j.ab.2007.08.016. PMID  17920029.
  22. ^ Itahana K, Campisi J, Dimri GP (2007). "Методы обнаружения биомаркеров клеточного старения" . Биологическое старение . Методы в молекулярной биологии. Т. 371. Humana Press. стр. 21–31. doi :10.1007/978-1-59745-361-5_3. ISBN 978-1-58829-658-0. PMID  17634571.
  23. ^ Lee BY, Han JA, Im JS, Morrone A, Johung K, Goodwin EC и др. (апрель 2006 г.). «Связанная со старением β-галактозидаза — это лизосомальная β-галактозидаза». Aging Cell . 5 (2): 187–95. doi :10.1111/j.1474-9726.2006.00199.x. hdl : 2158/216175 . PMID  16626397. S2CID  82432911.
  24. ^ Холл Б. Г. (январь 1977 г.). «Количество мутаций, необходимых для развития новой функции лактазы в Escherichia coli». Журнал бактериологии . 129 (1): 540–3. doi : 10.1128/JB.129.1.540-543.1977. PMC 234956. PMID  318653. 
  25. ^ Холл Б. Г. (июль 1981 г.). «Изменения в субстратной специфичности фермента в ходе направленной эволюции новых функций». Биохимия . 20 (14): 4042–9. doi :10.1021/bi00517a015. PMID  6793063.
  26. ^ Холл Б. Г. (октябрь 1976 г.). «Экспериментальная эволюция новой ферментативной функции. Кинетический анализ предковых (ebg) и эволюционировавших (ebg) ферментов». Журнал молекулярной биологии . 107 (1): 71–84. doi :10.1016/s0022-2836(76)80018-6. PMID  794482.
  27. ^ Stokes HW, Betts PW, Hall BG (ноябрь 1985 г.). «Последовательность гена ebgA Escherichia coli: сравнение с геном lacZ». Молекулярная биология и эволюция . 2 (6): 469–77. doi : 10.1093/oxfordjournals.molbev.a040372 . PMID  3939707.
  28. ^ Elliott AC, KS, Sinnott ML, Smith PJ, Bommuswamy J, Guo Z, et al. (Февраль 1992). "Каталитические последствия экспериментальной эволюции. Исследования структуры субъединицы второй (ebg) β-галактозидазы Escherichia coli и катализа ebgab, экспериментального эволюанта, содержащего две замены аминокислот". The Biochemical Journal . 282 (Pt 1) (1): 155–64. doi :10.1042/bj2820155. PMC 1130902 . PMID  1540130. 
  29. ^ Richmond ML, Gray JI, Stine CM (1981). «β-Галактозидаза: обзор последних исследований, связанных с технологическим применением, проблемами питания и иммобилизацией». Журнал молочной науки . 64 (9): 1759–1771. doi : 10.3168/jds.s0022-0302(81)82764-6 . ISSN  0022-0302.
  30. ^ abc Guo S, Song J, Zhang B, Jiang H, Ma R, Yu M (2018). «Идентификация и анализ экспрессии генов семейства β-галактозидазы на уровне генома во время размягчения плодов персика [ Prunus persica (L.) Batsch]». Postharvest Biology and Technology . 136 : 111–123. doi : 10.1016/j.postharvbio.2017.10.005.
  31. ^ abc Рохас А.Л., Нагем Р.А., Неустроев К.Н., Аранд М., Адамска М., Енейская Е.В. и др. (ноябрь 2004 г.). «Кристаллические структуры β-галактозидазы Penicillium sp. и ее комплекса с галактозой». Журнал молекулярной биологии . 343 (5): 1281–92. дои : 10.1016/j.jmb.2004.09.012. ПМИД  15491613.
  32. ^ Смит DL, Гросс KC (июль 2000 г.). «Семейство из по крайней мере семи генов β-галактозидазы экспрессируется во время развития плодов томата». Физиология растений . 123 (3): 1173–83. doi : 10.1104/pp.123.3.1173. PMC 59080. PMID  10889266. 

Внешние ссылки