В клеточной биологии микросомы представляют собой гетерогенные везикулоподобные артефакты (диаметром ~20-200 нм), которые повторно формируются из фрагментов эндоплазматического ретикулума (ЭР) при разрушении эукариотических клеток в лабораторных условиях ; в здоровых живых клетках микросомы отсутствуют. [1]
Шероховатые (содержащие рибосомы ) и гладкие (без рибосом) микросомы производятся из эндоплазматического ретикулума путем разрушения клеток . Эти микросомы имеют внутреннюю часть, которая точно такая же, как просвет эндоплазматического ретикулума. Обе формы микросом можно очистить с помощью процесса, известного как центрифугирование в равновесной плотности . Шероховатые и гладкие микросомы различаются по своим белкам, и шероховатые микросомы показали наличие трансляции и транслокации одновременно, помимо определенных исключений из белков в дрожжах.
Сигнальная гипотеза была выдвинута Гюнтером Блобелем и Дэвидом Сабатини в 1971 году, в которой утверждалось, что уникальная пептидная последовательность кодируется мРНК, специфичной для белков, предназначенных для транслокации через мембрану ЭР. Этот пептидный сигнал направляет активную рибосому к поверхности мембраны и создает условия для переноса зарождающегося полипептида через мембрану. Обобщение сигнальной гипотезы с целью включения сигналов для каждой органеллы и местоположения внутри клетки имело влияние, выходящее далеко за рамки освещения нацеливания секреторных белков, поскольку оно впервые ввело концепцию «топогенных» сигналов. До сигнальной гипотезы было почти немыслимо, что информация, закодированная в полипептидной цепи, может определять локализацию белков в клетке. [2]
Это относится к бесклеточному синтезу белка . Бесклеточный синтез белка, который происходит без микросом, не имеет возможности для включения в микросомы. Это означает, что когда микросомальные мембраны представлены позже, не происходит удаления сигнальной последовательности. При наличии микросом бесклеточный синтез белка демонстрирует котрансляционный транспорт белка в микросому и, следовательно, удаление сигнальной последовательности. Этот процесс производит зрелую белковую цепь. Исследования изучали процесс бесклеточного синтеза белка, когда микросомы лишены связанных с ними рибосом. Это объяснило некоторые детали о сигнальных последовательностях эндоплазматического ретикулума. Обычно секреторный белок имеет свою сигнальную последовательность, удаленную только в том случае, если микросомы присутствуют для синтеза белка из-за того, что секреторный белок включен в микросомы. Транспорт белка не происходит, если происходит позднее добавление микросом после завершения процесса синтеза белка.
Выдавливание белка в микросому можно описать несколькими факторами. Белок выдавливается, если он устойчив к протеазам , не устойчив к протеазам в присутствии детергентов или гликозилирован ферментами, находящимися в микросомах. Кроме того, еще одним признаком выдавливания белка является отщепление сигнальной пептидазой N-концевого сигнального пептида внутри микросомы, что может привести к уменьшению размера белка.
Микросомы также играют роль в экспериментах Pulse-Chase . Эксперименты Pulse-Chase показали, что секретируемые белки перемещаются через мембрану эндоплазматического ретикулума, когда мембраны очищаются. Было важно отделить эндоплазматический ретикулум от остальной части клетки, чтобы изучить транслокацию, но это невозможно из-за того, насколько он деликатен и взаимосвязан. Это позволило микросомам вступить в игру, поскольку они обладают большинством биохимических свойств эндоплазматического ретикулума. Микросомы образуются путем гомогенизации клеток, а небольшие закрытые пузырьки с рибосомами снаружи образуются в результате грубого распада эндоплазматического ретикулума. Когда микросомы обрабатывали протеазой, было обнаружено, что полипептид, произведенный рибосомами, заканчивается в микросомальном просвете. Это происходит, даже если белки производятся на цитозольной поверхности мембраны эндоплазматического ретикулума.
Другие эксперименты показали, что микросомы должны быть введены до того, как первые 70 аминокислот будут транслированы для того, чтобы секреторный белок попал в микросомальный просвет. В этот момент 40 аминокислот выступают из рибосомы, а 30 аминокислот после этого находятся в рибосомальном канале. Котрансляционная транслокация объясняет, что транспорт в просвет эндоплазматического ретикулума секреторных белков начинается с белка, все еще связанного с рибосомами и не полностью синтезированного. [3] Микросомы можно концентрировать и отделять от других клеточных остатков с помощью дифференциального центрифугирования . Неразрушенные клетки, ядра и митохондрии осаждаются при 10 000 g (где g — ускорение свободного падения Земли), тогда как растворимые ферменты и фрагментированный ЭР, содержащий цитохром P450 (CYP), остаются в растворе. При 100 000 g, достигаемом более быстрым вращением центрифуги, ER осаждается из раствора в виде осадка, но растворимые ферменты остаются в супернатанте . Таким образом, цитохром P450 в микросомах концентрируется и изолируется. Микросомы имеют красновато-коричневый цвет из-за присутствия гема . Из-за необходимости в многокомпонентной белковой системе микросомы необходимы для анализа метаболической активности CYP. Эти CYP очень распространены в печени крыс, мышей и людей, но присутствуют также во всех других органах и организмах.
Чтобы получить микросомы, содержащие определенный CYP или для большого количества активного фермента, микросомы готовятся из клеток насекомых Sf9 или в дрожжах с помощью гетерологичной экспрессии . Альтернативно может быть также выполнена экспрессия в Escherichia coli целых или усеченных белков. [4] [5] Таким образом, микросомы являются ценным инструментом для исследования метаболизма соединений (ингибирование ферментов, клиренс и идентификация метаболитов ) и для изучения взаимодействия лекарств с помощью исследований in vitro . Исследователи часто выбирают партии микросом на основе уровня активности ферментов определенных CYP. Некоторые партии доступны для изучения определенных популяций (например, микросомы легких курильщиков или некурящих) или разделены на классификации для соответствия целевым уровням активности CYP для исследований ингибирования и метаболизма .
Микросомы используются для имитации активности эндоплазматического ретикулума в пробирке и проведения экспериментов, требующих синтеза белка на мембране. Они дают ученым возможность выяснить, как белки производятся на ЭР в клетке, путем воссоздания процесса в пробирке.
Кифер и др. рассмотрели, как микросомы печени человека и гепатоциты человека используются для изучения метаболической стабильности и ингибирования для систем in vitro. Изучение их сходств и различий может пролить свет на механизмы метаболизма , пассивной проницаемости и транспортеров. Было показано, что пассивная проницаемость важна для метаболизма и ингибирования ферментов в гепатоцитах человека. Кроме того, отток P-gp играет меньшую роль в этой же области. Кроме того, микросомы печени более предсказывают, чем гепатоциты, клиренс in vivo, когда они дают более высокий внутренний клиренс, чем гепатоциты. [6]
Икбал, Джахангир и Аль-Карни изучали микросомальный белок переноса триглицеридов (MTP). MTP является резидентным белком эндоплазматического ретикулума и помогает переносить нейтральные липиды в зарождающийся аполипопротеин B. MTP широко используется для пациентов с абеталипопротеинемией с мутациями MTP из-за того, как он влияет на сборку и секрецию липопротеинов , содержащих apoB . Эти мутации MTP связаны с отсутствием циркуляции липопротеинов, содержащих apoB. MTP также участвует в биосинтезе эфира холестерина и кластера дифференциации 1d. Перенос сфинголипидов в липопротеины, содержащие apoB, также относится к способности MTP. MTP работает с гомеостазом липидов и липопротеинов и связан с определенными патофизиологическими состояниями и метаболическими заболеваниями . [7]
Ван и др. исследовали метаболизм лекарств in vitro с использованием микросом печени человека и фракций S9 печени человека. Исследование выявило значительные различия между микросомами печени человека и фракциями S9 печени человека в концентрациях ферментов, метаболизирующих лекарства, и транспортных белков. Белково-белковые корреляции этих ферментов, метаболизирующих лекарства, и транспортных белков были определены в отношении двух печеночных препаратов. [8]