Анализ транскрипции кассеты без G-G — это метод, используемый в молекулярной биологии для определения силы промотора in vitro . Метод включает в себя количественную оценку продукта мРНК с использованием плазмиды. [1] Кассета без G-G является частью предварительно сконструированного вектора, обычно содержащего сайт множественного клонирования (MCS) выше кассеты. По этой причине интересующие промоторы могут быть вставлены непосредственно в MCS, чтобы в конечном итоге измерить точность и эффективность промотора в рекрутинге транскрипционного аппарата.
Кассета G-less представляет собой репортерный ген , который кодирует транскрипт, в котором отсутствуют гуаниновые нуклеотиды в смысловой цепи ДНК (отсюда и « G -less»). [2] Плазмида, содержащая такой ген, расположена ниже MCS. После того, как промотор вставлен в MCS, транскрипция продолжается с добавлением радиоактивно меченых UTP, CTP и ATP (а также нерадиоактивно меченых/холодных нуклеотидов) и продолжается до тех пор, пока не будет достигнут конец кассеты G-less, и остатки гуанина снова не станут видны в смысловой цепи ДНК. Отсутствие GTP in vitro приводит к преждевременному завершению транскрипции на первом остатке гуанина в смысловой цепи, следующей за кассетой. Проводится гель-электрофорез продуктов транскрипции, и количество радиоактивности количественно определяется с помощью авторадиографии или фосфорной визуализации для определения силы интересующего промотора.
Методика кассеты без G-G используется для определения силы промотора за пределами базальных уровней транскрипции (т. е. в присутствии активаторов транскрипции или факторов транскрипции [3] ). Например, для измерения эффектов модификации консенсусной последовательности TATA-бокса в Saccharomyces cerevisiae в присутствии TFIID , кассеты без G-G были реализованы для измерения относительной силы каждого промотора. [4]
Анализ G-less может быть выполнен на кольцевой плазмиде для измерения уровней транскрипции. Кольцевая плазмида обеспечивает более эффективную матрицу во многих системах по сравнению с другими анализами, такими как транскрипция runoff, в которой требуется расщепленный конец. Этот метод генерирует радиоактивно меченые транскрипты очень эффективно, поскольку он обходит ненужный процесс выполнения других косвенных измерений продукта мРНК. Промотор вставляется в кольцевую плазмиду, содержащую кассету G-less, которая будет генерировать транскрипт определенной длины, который пропускает случайную и неспецифическую транскрипцию по всей плазмиде. Большинство грубых систем, таких как ядерные экстракты HeLa, используются, поскольку они содержат низкие количества загрязняющего GTP, который приводит к фоновой транскрипции и может иногда вызывать случайную транскрипцию, считываемую через кассету G-less. [5]