Библиотека кДНК представляет собой комбинацию клонированных фрагментов кДНК ( комплементарной ДНК ), вставленных в коллекцию клеток-хозяев, которые составляют некоторую часть транскриптома организма и хранятся как « библиотека ». кДНК производится из полностью транскрибированной мРНК , обнаруженной в ядре , и поэтому содержит только экспрессированные гены организма. Аналогичным образом могут быть получены тканеспецифические библиотеки кДНК. В эукариотических клетках зрелая мРНК уже сплайсирована , поэтому полученная кДНК не имеет интронов и может быть легко экспрессирована в бактериальной клетке. В то время как информация в библиотеках кДНК является мощным и полезным инструментом, поскольку продукты генов легко идентифицируются, в библиотеках отсутствует информация об энхансерах , интронах и других регуляторных элементах, обнаруженных в библиотеке геномной ДНК . [1] [2]
кДНК создается из зрелой мРНК из эукариотической клетки с использованием обратной транскриптазы . У эукариот поли-(А)-хвост (состоящий из длинной последовательности адениновых нуклеотидов) отличает мРНК от тРНК и рРНК и, следовательно, может использоваться в качестве праймерного участка для обратной транскрипции. Проблема в том, что не все транскрипты, например, для гистона , кодируют поли-А-хвост . [3] [4]
Во-первых, шаблон мРНК должен быть изолирован для создания библиотек кДНК. Поскольку мРНК содержит только экзоны, следует учитывать целостность изолированной мРНК, чтобы закодированный белок все еще мог быть произведен. Изолированная мРНК должна иметь размер от 500 п.н. до 8 к.б. [5] Существует несколько методов очистки РНК, таких как экстракция тризолом и очистка на колонке . Очистка на колонке может быть выполнена с использованием олигомерных нуклеотидных смол dT, а такие особенности мРНК, как наличие поли-А-хвоста, могут быть использованы, когда будут связываться только последовательности мРНК, содержащие указанную особенность. Затем желаемая мРНК, связанная с колонкой, элюируется .
После очистки мРНК олиго-dT- праймер (короткая последовательность дезокситимидиновых нуклеотидов) связывается с поли-A-хвостом РНК. Праймер необходим для инициирования синтеза ДНК ферментом обратной транскриптазой . Это приводит к созданию гибридов РНК-ДНК, в которых одна цепь комплементарной ДНК связана с цепью мРНК. [6] Для удаления мРНК фермент РНКаза H используется для расщепления остова мРНК и образования свободных 3'-ОН-групп, что важно для замены мРНК на ДНК. [5] Затем добавляется ДНК-полимераза I, расщепленная РНК действует как праймер, ДНК-полимераза I может идентифицировать и инициировать замену нуклеотидов РНК на нуклеотиды ДНК. [5] Это обеспечивается самой sscDNA, скручиваясь на 3'-конце, образуя петлю шпильки . Полимераза удлиняет конец 3'-ОН, а затем петля на конце 3' открывается под действием ножниц нуклеазы S 1. Затем для клонирования последовательностей в бактериальные плазмиды используются эндонуклеазы рестрикции и ДНК-лигаза .
Затем клонированные бактерии отбираются, обычно с использованием селекции антибиотиков. После отбора создаются запасы бактерий, которые впоследствии можно выращивать и секвенировать для составления библиотеки кДНК.
Библиотеки кДНК обычно используются при воспроизведении эукариотических геномов, поскольку объем информации сокращается для удаления большого количества некодирующих областей из библиотеки. Библиотеки кДНК используются для экспрессии эукариотических генов в прокариотах. Прокариоты не имеют интронов в своей ДНК и, следовательно, не обладают никакими ферментами, которые могут вырезать ее во время процесса транскрипции. кДНК не имеет интронов и, следовательно, может быть экспрессирована в прокариотических клетках. Библиотеки кДНК наиболее полезны в обратной генетике , где дополнительная геномная информация менее полезна. Кроме того, библиотеки кДНК часто используются в функциональном клонировании для идентификации генов на основе функции кодируемого белка. При изучении эукариотической ДНК библиотеки экспрессии конструируются с использованием комплементарной ДНК (кДНК), чтобы гарантировать, что вставка действительно является геном. [6]
Библиотека кДНК не имеет некодирующих и регуляторных элементов, которые есть в геномной ДНК. Библиотеки геномной ДНК предоставляют более подробную информацию об организме, но требуют больше ресурсов для создания и хранения.
Молекулы кДНК можно клонировать с помощью линкеров сайтов рестрикции. Линкеры представляют собой короткие двухцепочечные фрагменты ДНК ( олигодезоксирибонуклеотиды ) длиной около 8–12 пар нуклеотидов, которые включают сайт расщепления эндонуклеазой рестрикции, например BamHI. Как кДНК, так и линкер имеют тупые концы, которые можно лигировать вместе с использованием высокой концентрации ДНК-лигазы T4. Затем в молекуле кДНК образуются липкие концы путем расщепления концов кДНК (которые теперь имеют линкеры с включенным сайтом) соответствующей эндонуклеазой. Затем вектор клонирования ( плазмида ) также расщепляется соответствующей эндонуклеазой. После лигирования « липких концов » вставки в вектор полученная рекомбинантная молекула ДНК переносится в клетку-хозяина E. coli для клонирования.
{{cite book}}: CS1 maint: multiple names: authors list (link)