stringtranslate.com

Обратная транскриптаза

Обратная транскриптаза ( RT ) – это фермент , используемый для преобразования генома РНК в ДНК . Этот процесс называется обратной транскрипцией . Обратные транскриптазы используются вирусами , такими как ВИЧ и гепатит B, для репликации своих геномов, мобильными генетическими элементами ретротранспозонов для пролиферации в геноме хозяина и эукариотическими клетками для удлинения теломер на концах их линейных хромосом . Вопреки широко распространенному мнению, этот процесс не нарушает потоки генетической информации, описанные классической центральной догмой , поскольку передача информации от РНК к ДНК явно считается возможной. [2] [3] [4]

Ретровирусная RT обладает тремя последовательными биохимическими видами активности: активностью РНК-зависимой ДНК-полимеразы , активностью рибонуклеазы H (РНКаза H) и активностью ДНК-зависимой ДНК-полимеразы. В совокупности эти действия позволяют ферменту превращать одноцепочечную РНК в двухцепочечную кДНК. В ретровирусах и ретротранспозонах эта кДНК может затем интегрироваться в геном хозяина, из которого могут быть созданы новые копии РНК посредством транскрипции клетки-хозяина . Та же самая последовательность реакций широко используется в лаборатории для преобразования РНК в ДНК для использования в молекулярном клонировании , секвенировании РНК , полимеразной цепной реакции (ПЦР) или анализе генома .

История

Обратные транскриптазы были обнаружены Говардом Темином в Университете Висконсин-Мэдисон в вирионах саркомы Рауса [5] и независимо выделены Дэвидом Балтимором в 1970 году в Массачусетском технологическом институте из двух РНК-опухолевых вирусов: вируса мышиного лейкоза и снова вируса саркомы Рауса . [6] За свои достижения они разделили Нобелевскую премию по физиологии и медицине 1975 года (совместно с Ренато Дульбекко ).

Хорошо изученные обратные транскриптазы включают:

Функция в вирусах

Обратная транскриптаза показана на участках пальца, ладони и большого пальца. Каталитические аминокислоты активного центра РНКазы H и активного центра полимеразы показаны в форме шара и палочки.

Ферменты кодируются и используются вирусами, которые используют обратную транскрипцию в качестве этапа процесса репликации. РНК-вирусы с обратной транскрипцией , такие как ретровирусы , используют фермент для обратной транскрипции своих РНК- геномов в ДНК, которая затем интегрируется в геном хозяина и реплицируется вместе с ним. ДНК-вирусы с обратной транскрипцией , такие как гепаднавирусы , могут позволить РНК служить матрицей при сборке и создании цепей ДНК. ВИЧ заражает человека с помощью этого фермента. Без обратной транскриптазы вирусный геном не смог бы внедриться в клетку-хозяина, что привело бы к невозможности репликации. [ нужна цитата ]

Процесс обратной транскрипции или ретротранскрипции

Обратная транскриптаза создает двухцепочечную ДНК из матрицы РНК.

У видов вирусов с обратной транскриптазой, лишенной ДНК-зависимой активности ДНК-полимеразы, создание двухцепочечной ДНК может осуществляться с помощью ДНК-полимеразы δ , кодируемой хозяином , принимая вирусную ДНК-РНК за праймер и синтезируя двухцепочечную ДНК с помощью механизм аналогичен удалению праймера , когда вновь синтезированная ДНК заменяет исходную матрицу РНК. [ нужна цитата ]

Процесс обратной транскрипции, также называемый ретротранскрипцией или ретротрас, чрезвычайно подвержен ошибкам, и именно на этом этапе могут возникать мутации. Такие мутации могут вызвать устойчивость к лекарствам .

Ретровирусная обратная транскрипция

Механизм обратной транскрипции при ВИЧ. Номера шагов не совпадают.

Ретровирусы , также называемые вирусами оцРНК-RT класса VI , представляют собой вирусы с обратной транскрипцией РНК с промежуточной ДНК. Их геномы состоят из двух молекул одноцепочечной РНК с положительным смыслом с 5'-кэпом и 3'-полиаденилированным хвостом . Примеры ретровирусов включают вирус иммунодефицита человека ( ВИЧ ) и Т-лимфотропный вирус человека ( HTLV ). Создание двухцепочечной ДНК происходит в цитозоле [10] в виде серии следующих этапов:

  1. Лизил -тРНК действует как праймер и гибридизуется с комплементарной частью генома вирусной РНК, называемой сайтом связывания праймера или PBS.
  2. Затем обратная транскриптаза добавляет нуклеотиды ДНК к 3'-концу праймера, синтезируя ДНК, комплементарную U5 (некодирующей области) и области R (прямому повтору, обнаруженному на обоих концах молекулы РНК) вирусной РНК.
  3. Домен фермента обратной транскриптазы, называемый РНКазой H, разрушает области U5 и R на 5'-конце РНК.
  4. Затем праймер тРНК «перепрыгивает» на 3'-конец вирусного генома, и вновь синтезированные цепи ДНК гибридизуются с комплементарной областью R на РНК.
  5. Комплементарная ДНК (кДНК), добавленная в (2), дополнительно удлиняется.
  6. Большая часть вирусной РНК разрушается РНКазой H, остается только последовательность PP.
  7. Начинается синтез второй цепи ДНК, используя в качестве праймера оставшийся PP-фрагмент вирусной РНК.
  8. Праймер тРНК уходит и происходит «прыжок». PBS второй цепи гибридизуется с комплементарным PBS первой цепи.
  9. Обе цепи удлиняются, образуя полную двухцепочечную ДНК-копию исходного генома вирусной РНК, которая затем может быть включена в геном хозяина с помощью фермента интегразы .

Создание двухцепочечной ДНК также включает перенос цепи , при котором происходит транслокация продукта короткой ДНК из начального РНК-зависимого синтеза ДНК в области акцепторной матрицы на другом конце генома, которые позже достигаются и обрабатываются обратной транскриптазой. из-за его ДНК-зависимой активности ДНК. [11]

Ретровирусная РНК расположена от 5'-конца до 3'-конца. Место, где праймер отжигается с вирусной РНК, называется сайтом связывания праймера (PBS). 5'-конец РНК сайта PBS называется U5, а 3'-конец РНК сайта PBS называется лидером. Праймер тРНК раскручивается между 14 и 22 нуклеотидами и образует дуплекс пар оснований с вирусной РНК в PBS. Тот факт, что PBS расположен вблизи 5'-конца вирусной РНК, необычен, поскольку обратная транскриптаза синтезирует ДНК с 3'-конца праймера в направлении от 5' к 3' (относительно вновь синтезированной цепи ДНК). Следовательно, праймер и обратная транскриптаза должны быть перемещены на 3'-конец вирусной РНК. Чтобы осуществить это изменение положения, необходимы несколько этапов и различные ферменты, включая ДНК-полимеразу , рибонуклеазу H (РНКаза H) и раскручивание полинуклеотида. [12] [13]

Обратная транскриптаза ВИЧ также обладает рибонуклеазной активностью, которая разрушает вирусную РНК во время синтеза кДНК, а также ДНК-зависимой активностью ДНК-полимеразы, которая копирует смысловую цепь кДНК в антисмысловую ДНК с образованием двухцепочечного промежуточного продукта вирусной ДНК (вДНК). . [14] Структурные элементы вирусной РНК ВИЧ регулируют прогресс обратной транскрипции. [15]

В клеточной жизни

Самореплицирующиеся участки эукариотических геномов, известные как ретротранспозоны, используют обратную транскриптазу для перемещения из одного положения генома в другое через промежуточную РНК. Они в изобилии встречаются в геномах растений и животных. Теломераза — еще одна обратная транскриптаза, обнаруженная у многих эукариот, включая человека, которая несет собственную матрицу РНК ; эта РНК используется в качестве матрицы для репликации ДНК . [16]

Первые сообщения об обратной транскриптазе у прокариот появились еще в 1971 г. во Франции ( Белянский и др., 1971а, 1972) и несколькими годами позже в СССР (Ромащенко, 1977 [17] ). С тех пор они были широко описаны как часть бактериальных ретронов , отдельных последовательностей, которые кодируют обратную транскриптазу и используются в синтезе мсДНК . Чтобы инициировать синтез ДНК, необходим праймер. У бактерий праймер синтезируется во время репликации. [18]

Валериан Доля из штата Орегон утверждает, что вирусы благодаря своему разнообразию сыграли эволюционную роль в развитии клеточной жизни, при этом обратная транскриптаза играет центральную роль. [19]

Состав

Обратная транскриптаза использует «правую» структуру, аналогичную той, которая обнаружена в других полимеразах вирусных нуклеиновых кислот . [20] [21] Помимо функции транскрипции, ретровирусные обратные транскриптазы имеют домен, принадлежащий семейству РНКазы H , который жизненно важен для их репликации. Разрушая матрицу РНК, он позволяет синтезировать другую цепь ДНК. [22] Некоторые фрагменты переваривания также служат праймером для ДНК-полимеразы (того же фермента или белка-хозяина), ответственной за создание другой (плюсовой) цепи. [20]

Точность репликации

В течение жизненного цикла ретровируса существуют три различные системы репликации. Первый процесс — это обратный транскриптазный синтез вирусной ДНК из вирусной РНК, которая затем образует новые комплементарные цепи ДНК. Второй процесс репликации происходит, когда клеточная ДНК-полимераза хозяина реплицирует интегрированную вирусную ДНК. Наконец, РНК-полимераза II транскрибирует провирусную ДНК в РНК, которая упаковывается в вирионы. Мутация может произойти во время одного или всех этих этапов репликации. [23]

Обратная транскриптаза имеет высокий уровень ошибок при транскрипции РНК в ДНК, поскольку, в отличие от большинства других ДНК-полимераз , она не обладает способностью к корректуре . Такая высокая частота ошибок позволяет мутациям накапливаться с большей скоростью по сравнению с корректурными формами репликации. В руководствах компании указано, что коммерчески доступные обратные транскриптазы, производимые Promega, имеют частоту ошибок в диапазоне 1 на 17 000 оснований для AMV и 1 на 30 000 оснований для M-MLV. [24]

Было показано, что помимо создания однонуклеотидных полиморфизмов обратные транскриптазы участвуют в таких процессах, как слияние транскриптов, перестановка экзонов и создание искусственных антисмысловых транскриптов. [25] [26] Было высказано предположение, что эта активность обратной транскриптазы по переключению матрицы , которая может быть полностью продемонстрирована in vivo , могла быть одной из причин обнаружения нескольких тысяч неаннотированных транскриптов в геномах модельных организмов. [27]

Переключение шаблонов

В каждую ретровирусную частицу упакованы два генома РНК , но после заражения каждый вирус генерирует только один провирус . [28] После заражения обратная транскрипция сопровождается переключением матрицы между двумя копиями генома (рекомбинация выбора копии). [28] Есть две модели, которые предполагают, почему РНК-транскриптаза переключает шаблоны. Первая, модель принудительного выбора копии, предполагает, что обратная транскриптаза изменяет матрицу РНК, когда она встречает разрыв, подразумевая, что рекомбинация обязательна для поддержания целостности генома вируса. Вторая, модель динамического выбора, предполагает, что обратная транскриптаза меняет шаблоны, когда функция РНКазы и функция полимеразы не синхронизированы по скорости, подразумевая, что рекомбинация происходит случайным образом, а не в ответ на повреждение генома. Исследование Rawson et al. поддержал обе модели рекомбинации. [28] В каждом цикле репликации происходит от 5 до 14 событий рекомбинации на геном. [29] Переключение шаблонов (рекомбинация), по-видимому, необходимо для поддержания целостности генома и как механизм восстановления поврежденных геномов. [30] [28]

Приложения

Молекулярная структура зидовудина (АЗТ), препарата, используемого для ингибирования обратной транскриптазы.

Противовирусные препараты

Поскольку ВИЧ использует обратную транскриптазу для копирования своего генетического материала и создания новых вирусов (часть круга распространения ретровирусов), были разработаны специальные лекарства, чтобы нарушить этот процесс и тем самым подавить его рост. В совокупности эти препараты известны как ингибиторы обратной транскриптазы и включают нуклеозидные и нуклеотидные аналоги зидовудин (торговое название Ретровир), ламивудин (Эпивир) и тенофовир (Виреад), а также ненуклеозидные ингибиторы, такие как невирапин (Вирамун). [ нужна цитата ]

Молекулярная биология

Обратная транскриптаза обычно используется в исследованиях по применению метода полимеразной цепной реакции к РНК в методе, называемом полимеразной цепной реакцией с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР). Классический метод ПЦР можно применять только к цепям ДНК , но с помощью обратной транскриптазы РНК можно транскрибировать в ДНК, что делает возможным ПЦР- анализ молекул РНК. Обратная транскриптаза также используется для создания библиотек кДНК из мРНК . Коммерческая доступность обратной транскриптазы значительно улучшила знания в области молекулярной биологии, поскольку, наряду с другими ферментами , она позволила ученым клонировать, секвенировать и характеризовать РНК.

Смотрите также

Рекомендации

  1. ^ PDB : 3KLF ​; Ту Икс, Дас К., Хан Кью, Бауман Дж.Д., Кларк А.Д., Хоу Икс, Френкель Ю.В., Гаффни Б.Л., Джонс Р.А., Бойер П.Л., Хьюз С.Х., Сарафианос С.Г., Арнольд Э. (октябрь 2010 г.). «Структурные основы устойчивости ВИЧ-1 к АЗТ путем иссечения». Структурная и молекулярная биология природы . 17 (10): 1202–9. дои : 10.1038/nsmb.1908. ПМЦ  2987654 . ПМИД  20852643.
  2. ^ Крик Ф (август 1970 г.). «Центральная догма молекулярной биологии». Природа . 227 (5258): 561–3. Бибкод : 1970Natur.227..561C. дои : 10.1038/227561a0. PMID  4913914. S2CID  4164029.
  3. ^ Саркар С (1996). Философия и история молекулярной биологии: новые перспективы . Дордрехт: Kluwer Academic Publishers. стр. 187–232.
  4. ^ Данчин Э, Пошевиль А, Рей О, Пужоль Б, Бланше С (2019). «Эпигенетически облегченная мутационная ассимиляция: эпигенетика как центр инклюзивного эволюционного синтеза». Биологические обзоры . 94 (1): 259–282. дои : 10.1111/brv.12453 . ПМК 6378602 . S2CID  67861162. 
  5. ^ Темин Х.М., Мизутани С. (июнь 1970 г.). «РНК-зависимая ДНК-полимераза в вирионах вируса саркомы Рауса». Природа . 226 (5252): 1211–3. дои : 10.1038/2261211a0. PMID  4316301. S2CID  4187764.
  6. ^ Балтимор D (июнь 1970 г.). «РНК-зависимая ДНК-полимераза в вирионах РНК-опухолевых вирусов». Природа . 226 (5252): 1209–11. дои : 10.1038/2261209a0. PMID  4316300. S2CID  4222378.
  7. ^ Феррис А.Л., Хизи А., Шоуолтер С.Д., Пичуантес С., Бэйб Л., Крейк К.С., Хьюз Ш.Х. (апрель 1990 г.). «Иммунологический и протеолитический анализ структуры обратной транскриптазы ВИЧ-1» (PDF) . Вирусология . 175 (2): 456–64. дои : 10.1016/0042-6822(90)90430-у. ПМИД  1691562.
  8. ^ аб Кониси А., Ясукава К., Иноуе К. (июль 2012 г.). «Улучшение термической стабильности альфа-субъединицы обратной транскриптазы вируса миелобластоза птиц путем сайт-направленного мутагенеза» (PDF) . Биотехнологические письма . 34 (7): 1209–15. дои : 10.1007/s10529-012-0904-9. hdl : 2433/157247 . PMID  22426840. S2CID  207096569.
  9. ^ Autexier C, Лю Н.Ф. (июнь 2006 г.). «Структура и функция обратной транскриптазы теломеразы». Ежегодный обзор биохимии . 75 (1): 493–517. doi : 10.1146/annurev.biochem.75.103004.142412. ПМИД  16756500.
  10. ^ Bio-Medicine.org - Ретровирус, получено 17 февраля 2009 г.
  11. ^ Телесницкий А, Гофф С.П. (1993). «Сильная остановка переноса цепи во время обратной транскрипции». В Скалка М.А., Гофф С.П. (ред.). Обратная транскриптаза (1-е изд.). Нью-Йорк: Колд-Спринг-Харбор. п. 49. ИСБН 978-0-87969-382-4.
  12. ^ Бернштейн А, Вайс Р, Туз Дж (1985). «РНК-опухолевые вирусы». Молекулярная биология опухолевых вирусов (2-е изд.). Колд-Спринг-Харбор, Нью-Йорк: Лаборатория Колд-Спринг-Харбор.
  13. ^ Мёллинг К., Брокер Ф. (апрель 2015 г.). «Обратная транскриптаза-РНКаза H: от вирусов к противовирусной защите». Анналы Нью-Йоркской академии наук . 1341 (1): 126–35. Бибкод : 2015NYASA1341..126M. дои : 10.1111/nyas.12668. PMID  25703292. S2CID  42378727.
  14. ^ Кайзер GE (январь 2008 г.). «Жизненный цикл ВИЧ». Домашняя страница доктора Кайзера по микробиологии . Общественный колледж графства Балтимор. Архивировано из оригинала 26 июля 2010 г.
  15. ^ Крупкин М., Джексон Л.Н., Ха Б., Пуглиси Э.В. (декабрь 2020 г.). «Достижения в понимании инициации обратной транскрипции ВИЧ-1». Curr Opin Struct Biol . 65 : 175–183. doi :10.1016/j.sbi.2020.07.005. ПМЦ 9973426 . PMID  32916568. S2CID  221636459. 
  16. ^ Кригер М., Скотт М.П., ​​Мацудайра П.Т., Лодиш Х.Ф., Дарнелл Дж.Э., Зипурски Л., Кайзер С., Берк А. (2004). Молекулярно-клеточная биология . Нью-Йорк: WH Freeman and CO. ISBN 978-0-7167-4366-8.
  17. ^ Ромащенко А.Г. и др. (1977). «Отделение от препаратов ДНК-полимераз и РНК-зависимой ДНК-полимераз; очистка и свойства фермента». Известия Академии наук СССР . 233 : 734–737.
  18. ^ Гурвиц Дж., Лейс Дж. П. (январь 1972 г.). «РНК-зависимая ДНК-полимеразная активность РНК-опухолевых вирусов. I. Направляющее влияние ДНК в реакции». Журнал вирусологии . 9 (1): 116–29. дои : 10.1128/JVI.9.1.116-129.1972. ПМК 356270 . ПМИД  4333538. 
  19. ^ Арнольд С. (17 июля 2014 г.). «Могут ли гигантские вирусы быть источником жизни на Земле?». Национальная география . Архивировано из оригинала 18 июля 2014 года . Проверено 29 мая 2016 г.
  20. ^ аб Сарафианос С.Г., Маршан Б., Дас К., Химмель Д.М., Парняк М.А., Хьюз Ш., Арнольд Э. (январь 2009 г.). «Структура и функция обратной транскриптазы ВИЧ-1: молекулярные механизмы полимеризации и ингибирования». Журнал молекулярной биологии . 385 (3): 693–713. дои : 10.1016/j.jmb.2008.10.071. ПМЦ 2881421 . ПМИД  19022262. 
  21. ^ Хансен Дж.Л., Лонг AM, Шульц SC (август 1997 г.). «Структура РНК-зависимой РНК-полимеразы полиовируса». Состав . 5 (8): 1109–22. дои : 10.1016/S0969-2126(97)00261-X . ПМИД  9309225.
  22. ^ Шульц SJ, Шампу JJ (июнь 2008 г.). «Активность РНКазы H: структура, специфичность и функция в обратной транскрипции». Вирусные исследования . 134 (1–2): 86–103. doi : 10.1016/j.virusres.2007.12.007. ПМЦ 2464458 . ПМИД  18261820. 
  23. ^ Ббенек К., Кункель А.Т. (1993). «Верность ретровирусных обратных транскриптаз». В Скалка М.А., Гофф П.С. (ред.). Обратная транскриптаза . Нью-Йорк: Лабораторное издательство Колд-Спринг-Харбор. п. 85. ИСБН 978-0-87969-382-4.
  24. ^ «Руководство по эксплуатации комплекта Promega» (PDF) . 1999. Архивировано из оригинала (PDF) 21 ноября 2006 г.
  25. ^ Хаусли Дж., Толлерви Д. (август 2010 г.). «Очевидный неканонический транс-сплайсинг генерируется обратной транскриптазой in vitro». ПЛОС ОДИН . 5 (8): e12271. Бибкод : 2010PLoSO...512271H. дои : 10.1371/journal.pone.0012271 . ПМЦ 2923612 . ПМИД  20805885. 
  26. ^ Цзэн XC, Ван SX (июнь 2002 г.). «Доказательства того, что кДНК BmTXK бета-BmKCT китайского скорпиона Buthus martensii Karsch является артефактом, возникающим в процессе обратной транскрипции». Письма ФЭБС . 520 (1–3): 183–4, ответ автора 185. doi : 10.1016/S0014-5793(02)02812-0 . PMID  12044895. S2CID  24619868.
  27. ^ ван Бакель Х., Нислоу С., Бленкоу Б.Дж., Хьюз Т.Р. (2011). «Ответ на «Реальность повсеместной транскрипции»». ПЛОС Биология . 9 (7): e1001102. дои : 10.1371/journal.pbio.1001102 . ПМК 3134445 . 
  28. ^ abcd Роусон Дж. М., Николаичик О. А., Кил Б. Ф., Патак В. К., Ху WS (ноябрь 2018 г.). «Рекомбинация необходима для эффективной репликации ВИЧ-1 и поддержания целостности вирусного генома». Исследования нуклеиновых кислот . 46 (20): 10535–10545. дои : 10.1093/nar/gky910. ПМК 6237782 . ПМИД  30307534. 
  29. ↑ Кромер Д., Гримм А.Дж., Шлуб Т.Э., Мак Дж., член парламента Давенпорта (январь 2016 г.). «Оценка скорости переключения и рекомбинации матрицы ВИЧ in vivo». СПИД . 30 (2): 185–92. дои : 10.1097/QAD.0000000000000936 . PMID  26691546. S2CID  20086739.
  30. ^ Ху WS, Темин HM (ноябрь 1990 г.). «Ретровирусная рекомбинация и обратная транскрипция». Наука . 250 (4985). Нью-Йорк, штат Нью-Йорк: 1227–33. Бибкод : 1990Sci...250.1227H. дои : 10.1126/science.1700865. ПМИД  1700865.

Внешние ссылки