В молекулярной биологии биочипы представляют собой сконструированные субстраты («миниатюрные лаборатории»), которые могут одновременно проводить большое количество биохимических реакций. Одной из целей технологии биочипов является эффективный скрининг большого количества биологических аналитов с потенциальными применениями от диагностики заболеваний до обнаружения агентов биотерроризма . Например, цифровые микрожидкостные биочипы изучаются для применения в биомедицинских областях. В цифровом микрожидкостном биочипе группа (смежных) ячеек в микрожидкостном массиве может быть сконфигурирована для работы в качестве хранилища, функциональных операций, а также для динамической транспортировки капель жидкости. [1]
Разработка началась с ранней работы над базовой технологией сенсора . Одним из первых портативных сенсоров на основе химии был стеклянный pH-электрод, изобретенный в 1922 году Хьюзом. [2] Основная концепция использования обменных участков для создания проницаемых селективных мембран была использована для разработки других ионных сенсоров в последующие годы. Например, сенсор K + был получен путем включения валиномицина в тонкую мембрану. [3]
В 1953 году Уотсон и Крик объявили о своем открытии теперь уже знакомой двойной спирали молекул ДНК и заложили основу для генетических исследований, которые продолжаются и по сей день. [4] Разработка методов секвенирования в 1977 году Гилбертом [5] и Сэнгером [6] (работавшими отдельно) позволила исследователям напрямую считывать генетические коды, которые содержат инструкции для синтеза белка . Это исследование показало, как гибридизация комплементарных одиночных олигонуклеотидных цепей может быть использована в качестве основы для зондирования ДНК. Две дополнительные разработки позволили использовать технологию, используемую в современных ДНК-ориентированных методах. Во-первых, в 1983 году Кэри Маллис изобрел метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), [4] метод амплификации концентраций ДНК. Это открытие сделало возможным обнаружение чрезвычайно малых количеств ДНК в образцах. Во-вторых, в 1986 году Худ и его коллеги разработали метод маркировки молекул ДНК флуоресцентными метками вместо радиоактивных меток, [7] что позволило проводить оптическое наблюдение за экспериментами по гибридизации.
На рисунке 1 показан состав типичной платформы биочипа. Фактический сенсорный компонент (или «чип») — это всего лишь одна часть полной системы анализа. Трансдукция должна быть выполнена для перевода фактического сенсорного события (связывание ДНК, окисление/восстановление и т. д. ) в формат, понятный компьютеру ( напряжение , интенсивность света, масса и т. д. ), что затем позволяет провести дополнительный анализ и обработку для получения окончательного, читаемого человеком результата. Множество технологий, необходимых для создания успешного биочипа — от сенсорной химии до микрочипов и обработки сигналов — требуют настоящего междисциплинарного подхода, что делает барьер для входа высоким. Один из первых коммерческих биочипов был представлен Affymetrix . Их продукты «GeneChip» содержат тысячи отдельных сенсоров ДНК для использования в сенсорных дефектах или однонуклеотидных полиморфизмах (SNP) в таких генах, как p53 (супрессор опухолей) и BRCA1 и BRCA2 (связанные с раком молочной железы). [8] Чипы производятся с использованием методов микролитографии, традиционно используемых для изготовления интегральных схем (см. ниже).
Микроматрица — плотная двумерная сетка биосенсоров — является критически важным компонентом платформы биочипа. Обычно сенсоры размещаются на плоской подложке, которая может быть пассивной ( например , кремниевой или стеклянной) или активной, причем последняя состоит из интегрированной электроники или микромеханических устройств, которые выполняют или способствуют передаче сигнала. Поверхностная химия используется для ковалентного связывания молекул сенсора с субстратом. Изготовление микроматриц — нетривиальная задача, которая является серьезным экономическим и технологическим препятствием, которое в конечном итоге может определить успех будущих платформ биочипов. Основной производственной проблемой является процесс размещения каждого сенсора в определенном положении (обычно на декартовой сетке) на подложке. Существуют различные способы размещения, но обычно для размещения крошечных пятен сенсорного материала на поверхности чипа используются роботизированные системы микропипетирования [9] или микропечати [10] . Поскольку каждый сенсор уникален, за один раз можно разместить только несколько пятен. Низкопроизводительная природа этого процесса приводит к высоким производственным затратам.
Фодор и его коллеги разработали уникальный процесс изготовления (позже использованный Affymetrix ), в котором серия этапов микролитографии используется для комбинаторного синтеза сотен тысяч уникальных одноцепочечных ДНК-сенсоров на подложке по одному нуклеотиду за раз. [11] [12] Для каждого типа основания требуется один этап литографии; таким образом, для каждого уровня нуклеотида требуется в общей сложности четыре этапа. Хотя эта технология очень эффективна, поскольку позволяет создавать множество сенсоров одновременно, в настоящее время она применима только для создания коротких цепей ДНК (15–25 нуклеотидов). Факторы надежности и стоимости ограничивают количество этапов фотолитографии, которые могут быть выполнены. Кроме того, методы комбинаторного синтеза, направленные на свет, в настоящее время невозможны для белков или других сенсорных молекул.
Как отмечено выше, большинство микроматриц состоят из декартовой сетки датчиков. Этот подход используется в основном для сопоставления или «кодирования» координаты каждого датчика с его функцией. Датчики в этих матрицах обычно используют универсальную сигнальную технику ( например, флуоресценцию), таким образом делая координаты их единственным идентифицирующим признаком. Эти матрицы должны быть созданы с использованием последовательного процесса ( т. е. требующего нескольких последовательных шагов), чтобы гарантировать, что каждый датчик размещен в правильном положении.
«Случайное» изготовление, при котором датчики размещаются в произвольных местах на чипе, является альтернативой последовательному методу. Утомительный и дорогостоящий процесс позиционирования не требуется, что позволяет использовать параллельные методы самосборки. При таком подходе можно производить большие партии идентичных датчиков; датчики из каждой партии затем объединяются и собираются в массив. Для идентификации каждого датчика должна использоваться некоординатная схема кодирования. Как показано на рисунке, такая конструкция была впервые продемонстрирована (а затем коммерциализирована Illumina) с использованием функционализированных шариков, размещенных случайным образом в лунках протравленного оптоволоконного кабеля. [13] [14] Каждый шарик был уникально закодирован с помощью флуоресцентной сигнатуры. Однако эта схема кодирования ограничена по количеству уникальных комбинаций красителей, которые можно использовать и успешно дифференцировать.
Микрочипы не ограничиваются анализом ДНК ; белковые микрочипы , антитела микрочипы , химические соединения микрочипы также могут быть получены с использованием биочипов. Randox Laboratories Ltd. запустила Evidence, первый анализатор белковой технологии биочипов в 2003 году. В белковой технологии биочипов биочип заменяет планшет ELISA или кювету в качестве реакционной платформы. Биочип используется для одновременного анализа панели связанных тестов в одном образце, создавая профиль пациента . Профиль пациента может использоваться при скрининге заболеваний, диагностике , мониторинге прогрессирования заболевания или мониторинге лечения. Одновременное выполнение нескольких анализов, описываемое как мультиплексирование, позволяет значительно сократить время обработки и количество требуемого образца пациента. Технология биочипов представляет собой новое применение знакомой методологии, использующей сэндвич-иммуноанализ, конкурентный и иммуноферментный анализ с захватом антител . Отличие от обычных иммуноферментных анализов заключается в том, что лиганды захвата ковалентно прикреплены к поверхности биочипа в упорядоченном массиве, а не в растворе.
В сэндвич-анализах используется антитело, меченое ферментом; в конкурентных анализах используется антиген, меченый ферментом. При связывании антитела с антигеном реакция хемилюминесценции производит свет. Детектирование осуществляется камерой с зарядовой связью (ПЗС). Камера ПЗС представляет собой чувствительный и высокоразрешающий датчик, способный точно обнаруживать и количественно определять очень низкие уровни света. Тестовые области располагаются с использованием сетки, затем сигналы хемилюминесценции анализируются программным обеспечением для визуализации для быстрого и одновременного количественного определения отдельных аналитов.
Биочипы также используются в области микрофизиометрии , например, в приложениях «кожа на чипе » [15] .
Подробную информацию о других технологиях матриц см. в разделе Микроматрица антител .
