Технология гибридомы — это метод получения большого количества идентичных антител , также называемых моноклональными антителами . Этот процесс начинается с инъекции мыши (или другому млекопитающему) антигена, который вызывает иммунный ответ. Тип лейкоцита, В-клетка , вырабатывает антитела, которые связываются с введенным антигеном. Эти В-клетки, продуцирующие антитела, затем извлекаются из мыши и, в свою очередь, сливаются с бессмертными клетками рака миеломы , чтобы получить гибридную клеточную линию, называемую гибридомой , которая обладает как способностью продуцировать антитела В-клетки, так и долговечностью и репродуктивностью миеломы.
Гибридомы можно выращивать в культуре, причем каждая культура начинается с одной жизнеспособной гибридомной клетки, производя культуры, каждая из которых состоит из генетически идентичных гибридом, которые производят одно антитело на культуру (моноклональные), а не смеси различных антител (поликлональные). Линия клеток миеломы, которая используется в этом процессе, выбирается по ее способности расти в культуре ткани и по отсутствию синтеза антител. В отличие от поликлональных антител , которые представляют собой смеси многих различных молекул антител, моноклональные антитела, продуцируемые каждой линией гибридомы, все химически идентичны.
Производство моноклональных антител было изобретено Сезаром Мильштейном и Жоржем Ж. Ф. Келером в 1975 году. Они разделили Нобелевскую премию 1984 года по медицине и физиологии с Нильсом Каем Йерне , который внес и другие вклады в иммунологию. Термин гибридома был придуман Леонардом Герценбергом во время его творческого отпуска в лаборатории Сезара Мильштейна в 1976–1977 годах. [1]
Лабораторные животные ( млекопитающие , например, мыши) сначала подвергаются воздействию антигена, против которого должно быть получено антитело. Обычно это делается с помощью серии инъекций рассматриваемого антигена в течение нескольких недель. За этими инъекциями обычно следует использование электропорации in vivo , которая значительно усиливает иммунный ответ. После того, как спленоциты изолированы из селезенки млекопитающего , В-клетки сливаются с бессмертными миеломными клетками. Слияние В-клеток с миеломными клетками может быть осуществлено с помощью электрослияния. Электрослияние заставляет В-клетки и миеломные клетки выравниваться и сливаться с применением электрического поля. В качестве альтернативы, В-клетки и миеломы могут быть слиты с помощью химических протоколов, чаще всего с использованием полиэтиленгликоля . Клетки миеломы отбираются заранее, чтобы убедиться, что они сами не секретируют антитела и что у них отсутствует ген гипоксантин-гуанинфосфорибозилтрансферазы (HGPRT), что делает их чувствительными (или уязвимыми) к среде HAT (см. ниже).
Слитые клетки инкубируют в среде HAT ( среда гипоксантин - аминоптерин - тимидин ) примерно от 10 до 14 дней. Аминоптерин блокирует путь, который позволяет синтезировать нуклеотиды. Следовательно, неслитые клетки миеломы погибают, так как они не могут производить нуклеотиды de novo или спасательными путями , поскольку у них отсутствует HGPRT. Удаление неслитых клеток миеломы необходимо, так как они могут перерасти другие клетки, особенно слабо устоявшиеся гибридомы. Неслитые В-клетки погибают, так как у них короткая продолжительность жизни. Таким образом, выживают только гибриды В-клеток-миеломы, так как ген HGPRT, исходящий от В-клеток, является функциональным. Эти клетки вырабатывают антитела (свойство В-клеток) и бессмертны (свойство миеломных клеток). Затем инкубированную среду разбавляют в многолуночных планшетах до такой степени, чтобы каждая лунка содержала только одну клетку. Поскольку антитела в лунке вырабатываются одной и той же В-клеткой, они будут направлены к одному и тому же эпитопу и, таким образом, являются моноклональными антителами.
Следующий этап — быстрый процесс первичного скрининга, который идентифицирует и выбирает только те гибридомы, которые продуцируют антитела соответствующей специфичности. Первый используемый метод скрининга называется ELISA . Затем супернатант культуры гибридомы, вторичный ферментно-меченый конъюгат и хромогенный субстрат инкубируются, и образование окрашенного продукта указывает на положительную гибридому. В качестве альтернативы можно использовать иммуноцитохимический, [2] вестерн-блот и иммунопреципитационную масс-спектрометрию. В отличие от анализов вестерн-блоттинга, иммунопреципитационная масс-спектрометрия облегчает скрининг и ранжирование клонов, которые связываются с нативными (неденатурированными) формами белков антигена. [3] Скрининг с помощью проточной цитометрии использовался для первичного скрининга большого количества (~1000) клонов гибридомы, распознающих нативную форму антигена на поверхности клетки. [4] При скрининге на основе проточной цитометрии в качестве антигена для тестирования каждого образца супернатанта гибридомы используется смесь антиген-отрицательных и антиген-положительных клеток. [4]
В-клетки, которые производят желаемые антитела, можно клонировать для получения множества идентичных дочерних клонов. Дополнительные среды, содержащие интерлейкин-6 (например, бриклон), необходимы для этого шага. После того, как колония гибридомы установлена, она будет непрерывно расти в культуральной среде, такой как RPMI-1640 (с антибиотиками и сывороткой плода крупного рогатого скота) и производить антитела. [2]
Многолуночные планшеты изначально используются для выращивания гибридом, а после отбора заменяются на более крупные колбы для культивирования тканей. Это поддерживает благополучие гибридом и обеспечивает достаточное количество клеток для криоконсервации и супернатанта для последующих исследований. Супернатант культуры может дать от 1 до 60 мкг/мл моноклонального антитела, которое хранится при температуре -20 °C или ниже, пока не потребуется. [2]
Используя культуральный супернатант или очищенный препарат иммуноглобулина, можно провести дальнейший анализ потенциальной гибридомы, продуцирующей моноклональные антитела, с точки зрения реактивности, специфичности и перекрестной реактивности. [2]
Использование моноклональных антител многочисленно и включает профилактику, диагностику и лечение заболеваний. Например, моноклональные антитела могут различать подмножества В-клеток и Т-клеток , что полезно при идентификации различных типов лейкемии . Кроме того, специфические моноклональные антитела использовались для определения маркеров клеточной поверхности на лейкоцитах и других типах клеток. Это привело к кластеру серий маркеров дифференциации. Их часто называют маркерами CD, и они определяют несколько сотен различных компонентов клеточной поверхности клеток, каждый из которых определяется связыванием определенного моноклонального антитела. Такие антитела чрезвычайно полезны для сортировки клеток с активацией флуоресценции , специфической изоляции определенных типов клеток.
С помощью моноклональных антител ткани и органы могут быть классифицированы на основе их экспрессии определенных маркеров, которые отражают тканевой или клеточный генез. Простатический специфический антиген , плацентарная щелочная фосфатаза , хорионический гонадотропин человека , α-фетопротеин и другие являются антигенами, ассоциированными с органами, и выработка моноклональных антител против этих антигенов помогает определить природу первичной опухоли. [2]
Моноклональные антитела особенно полезны для различения морфологически схожих поражений, таких как плевральная и перитонеальная мезотелиома , аденокарцинома , а также для определения происхождения органа или ткани недифференцированных метастазов . Выбранные моноклональные антитела помогают в обнаружении скрытых метастазов ( рак неизвестного первичного происхождения ) с помощью иммуноцитологического анализа костного мозга, других аспиратов тканей, а также лимфатических узлов и других тканей и могут иметь повышенную чувствительность по сравнению с обычным гистопатологическим окрашиванием . [2]
В одном исследовании [5] был проведен чувствительный иммуногистохимический анализ аспиратов костного мозга 20 пациентов с локализованным раком предстательной железы. В анализе использовались три моноклональных антитела (T16, C26 и AE-1), способных распознавать мембранные и цитоскелетные антигены, экспрессируемые эпителиальными клетками, для обнаружения опухолевых клеток. Аспираты костного мозга 22% пациентов с локализованным раком предстательной железы (стадия B, 0/5; стадия C, 2/4) и 36% пациентов с метастатическим раком предстательной железы (стадия D1, 0/7 пациентов; стадия D2, 4/4 пациентов) имели антиген-положительные клетки в костном мозге. Был сделан вывод, что иммуногистохимическое окрашивание аспиратов костного мозга очень полезно для обнаружения скрытых метастазов костного мозга у пациентов с явно локализованным раком предстательной железы.
Хотя иммуноцитохимия с использованием опухолеассоциированных моноклональных антител привела к улучшению способности обнаруживать скрытые клетки рака молочной железы в аспиратах костного мозга и периферической крови, необходимо дальнейшее развитие этого метода, прежде чем его можно будет использовать в повседневной практике. [6] Одним из основных недостатков иммуноцитохимии является то, что используются только опухолеассоциированные, а не опухолеспецифические моноклональные антитела, и в результате может возникнуть некоторая перекрестная реакция с нормальными клетками. [7]
Для эффективного определения стадии рака молочной железы и оценки эффективности режимов очистки перед инфузией аутологичных стволовых клеток важно обнаружить даже небольшие количества клеток рака молочной железы. Иммуногистохимические методы идеально подходят для этой цели, поскольку они просты, чувствительны и довольно специфичны. Франклин и др. [8] провели чувствительный иммуноцитохимический анализ, используя комбинацию четырех моноклональных антител (260F9, 520C9, 317G5 и BrE-3) против гликопротеинов поверхности опухолевых клеток, чтобы идентифицировать клетки опухоли молочной железы в костном мозге и периферической крови. Из результатов они сделали вывод, что иммуноцитохимическое окрашивание костного мозга и периферической крови является чувствительным и простым способом обнаружения и количественной оценки клеток рака молочной железы.
Одной из основных причин метастатического рецидива у пациентов с солидными опухолями является раннее распространение злокачественных клеток. Использование моноклональных антител (mAbs), специфичных к цитокератинам, позволяет идентифицировать распространенные отдельные эпителиальные опухолевые клетки в костном мозге.
В одном исследовании [9] сообщается о разработке иммуноцитохимической процедуры для одновременной маркировки цитокератинового компонента № 18 (CK18) и простатического специфического антигена (PSA). Это поможет в дальнейшей характеристике распространенных отдельных эпителиальных опухолевых клеток у пациентов с раком простаты. Двенадцать контрольных аспиратов от пациентов с доброкачественной гиперплазией простаты показали отрицательное окрашивание, что дополнительно подтверждает специфичность CK18 в обнаружении эпителиальных опухолевых клеток в костном мозге.
В большинстве случаев злокачественных заболеваний, осложненных выпотом, неопластические клетки легко распознаются. Однако в некоторых случаях злокачественные клетки не так легко обнаружить или их присутствие слишком сомнительно, чтобы назвать это положительным заключением. Использование иммуноцитохимических методов повышает точность диагностики в этих случаях.
Гош, Мейсон и Сприггс [10] проанализировали 53 образца плевральной или перитонеальной жидкости от 41 пациента со злокачественным заболеванием. Традиционное цитологическое исследование не выявило никаких неопластических клеток. Для поиска злокачественных клеток использовались три моноклональных антитела (анти-CEA, Ca 1 и HMFG-2). Иммуноцитохимическая маркировка проводилась на неокрашенных мазках, которые хранились при температуре -20 °C до 18 месяцев. Двенадцать из сорока одного случая, в которых проводилось иммуноцитохимическое окрашивание, выявили злокачественные клетки. Результат представлял собой увеличение диагностической точности примерно на 20%. Исследование пришло к выводу, что у пациентов с подозрением на злокачественное заболевание иммуноцитохимическая маркировка должна использоваться рутинно при исследовании цитологически отрицательных образцов и имеет важные последствия в отношении ведения пациентов.
Другое применение иммуноцитохимического окрашивания — обнаружение двух антигенов в одном мазке. Двойное окрашивание антителами легкой цепи и маркерами Т- и В-клеток может указывать на неопластическое происхождение лимфомы. [11]
В одном исследовании сообщалось о выделении линии гибридомных клеток (клон 1E10), которая производит моноклональное антитело (IgM, изотип k). Это моноклональное антитело показывает специфическое иммуноцитохимическое окрашивание ядрышек. [12]
Ткани и опухоли можно классифицировать на основе экспрессии определенных маркеров с помощью моноклональных антител. Они помогают различать морфологически схожие поражения и определять органное или тканевое происхождение недифференцированных метастазов. Иммуноцитологический анализ костного мозга, аспиратов тканей, лимфатических узлов и т. д. с выбранными моноклональными антителами помогает обнаруживать скрытые метастазы. Моноклональные антитела повышают чувствительность при обнаружении даже небольших количеств инвазивных или метастатических клеток. Моноклональные антитела (mAbs), специфичные для цитокератинов, могут обнаруживать диссеминированные отдельные эпителиальные опухолевые клетки в костном мозге.