ДНК-оригами — это наномасштабное складывание ДНК для создания произвольных двух- и трехмерных форм в наномасштабе . Специфика взаимодействий между комплементарными парами оснований делает ДНК полезным строительным материалом благодаря дизайну ее последовательностей оснований. [2] ДНК — это хорошо изученный материал, который подходит для создания каркасов, удерживающих другие молекулы на месте, или для создания структур самостоятельно.
ДНК-оригами стало главной темой журнала Nature от 16 марта 2006 года. [3] С тех пор ДНК-оригами вышло за рамки искусства и нашло множество применений: от систем доставки лекарств до использования в качестве схем в плазмонных устройствах; однако большинство коммерческих приложений остаются на стадии концепций или тестирования. [4]
Идея использования ДНК в качестве строительного материала была впервые представлена в начале 1980-х годов Надрианом Симаном . [5] Метод ДНК-оригами был разработан Полом Ротемундом в Калифорнийском технологическом институте . [6] В отличие от распространенных методов изготовления сверху вниз, таких как 3D-печать или литография, которые включают в себя нанесение или удаление материала с помощью инструмента, ДНК-нанотехнология, а также ДНК-оригами как подмножество, являются методом изготовления снизу вверх. Благодаря рациональному проектированию составных субъединиц полимера ДНК, ДНК может самостоятельно собираться в различные формы. Процесс построения ДНК-оригами включает в себя сворачивание длинной одиночной цепи вирусной ДНК (обычно 7249 п.н. геномной ДНК бактериофага M13 ) с помощью нескольких более мелких «скрепочных» цепей. Эти более короткие цепи связывают более длинные в разных местах, что приводит к образованию заранее определенной двух- или трехмерной формы. [7] Примерами могут служить смайлик и грубая карта Китая и Америки, а также множество трехмерных структур, таких как кубы. [8]
Есть несколько свойств ДНК, которые делают молекулу идеальным строительным материалом для ДНК-оригами. Цепи ДНК имеют естественную тенденцию связываться со своими комплементарными последовательностями посредством спаривания оснований Уотсона-Крика . Это позволяет скрепочным цепям определять положение на нити каркаса без каких-либо внешних манипуляций, что приводит к самосборке желаемой структуры.
Специфическая последовательность оснований в ДНК придает материалу элемент программируемости, определяя его связывающее поведение. Тщательное проектирование последовательностей скрепочных нитей позволяет ученым точно направлять сворачивание скрепочной нити в заданную форму с высокой точностью. [9]
На химическом уровне водородные связи, которые существуют между комплементарными парами оснований, обеспечивают прочность и стабильность сложенных структур ДНК-оригами. Кроме того, ДНК является относительно стабильной молекулой, предлагающей устойчивость в физиологических условиях. [9]
Одним из преимуществ использования наноструктуры ДНК-оригами по сравнению с иным образом классифицированной ДНК-наноструктурой является простота определения конечных структур. [10] При проектировании некоторых других ДНК-наноструктур может быть непрактично проектировать чрезвычайно большое количество индивидуальных нитей, если вся структура состоит из более мелких нитей. Одним из методов обхода необходимости в огромном количестве различных нитей является использование повторяющихся единиц, что имеет недостаток в виде распределения размеров, а иногда и форм. ДНК-оригами, однако, образует дискретные структуры. [10]
Приложения для ДНК-оригами в основном сосредоточены вокруг возможности осуществлять точный контроль над системами, особенно путем ограничения положения молекул, как правило, путем присоединения к наноструктурам ДНК-оригами. Текущие приложения в основном сосредоточены вокруг зондирования и доставки лекарств, но были исследованы многие дополнительные приложения.
Изготовление объектов ДНК-оригами требует предварительной интуиции трехмерного структурного дизайна ДНК. Это может быть трудно понять из-за сложности исключительного использования пар аденин - тимин и пар гуанин - цитозин для сворачивания и распутывания двухспиральных молекул ДНК таким образом, чтобы выходные нити производили уникальные желаемые формы.
Программное обеспечение для проектирования и выбор последовательностей пар оснований становятся решающими для создания сложных 2D или даже 3D фигур, поскольку ключ к ДНК-оригами заключается в точном спаривании оснований между двумя строительными блоками техники: нитями скрепок и каркасом. Это обеспечивает специфическое связывание и точное складывание. Нить каркаса представляет собой длинную одноцепочечную молекулу ДНК, часто получаемую из вируса. Нить скрепок представляет собой более короткие нити ДНК, предназначенные для связывания с определенными последовательностями на нити каркаса, диктуя ее складывание. [9]
Для создания желаемой формы изображения рисуются с помощью растровой заливки одной длинной молекулы ДНК . Затем этот дизайн вводится в компьютерную программу, которая вычисляет размещение отдельных скрепочных нитей. Каждая скрепка связывается с определенной областью шаблона ДНК, и, таким образом, благодаря спариванию оснований Уотсона-Крика , необходимые последовательности всех скрепочных нитей известны и отображаются. ДНК смешивается, затем нагревается и охлаждается. По мере охлаждения ДНК различные скрепки вытягивают длинную нить в желаемую форму. Дизайны можно непосредственно наблюдать несколькими методами, включая электронную микроскопию , атомно-силовую микроскопию или флуоресцентную микроскопию, когда ДНК связана с флуоресцентными материалами. [6]
Методы самосборки «снизу вверх» считаются перспективными альтернативами, которые предлагают дешевый параллельный синтез наноструктур в относительно мягких условиях.
С момента создания этого метода было разработано программное обеспечение для помощи в процессе с использованием программного обеспечения САПР . Это позволяет исследователям использовать компьютер для определения способа создания правильных скоб, необходимых для формирования определенной формы. Одно из таких программ, называемое caDNAno, является программным обеспечением с открытым исходным кодом для создания таких структур из ДНК. Использование программного обеспечения не только увеличило простоту процесса, но и радикально сократило ошибки, допущенные при ручных вычислениях. [11] [5]
После тщательного планирования последовательности скрепочных нитей с помощью программного обеспечения, чтобы гарантировать, что они связывают нить каркаса в предполагаемых точках, разработанные последовательности скрепочных нитей синтезируются в лаборатории с использованием таких методов, как автоматизированный синтез ДНК. Наконец, нить каркаса и скрепочные нити смешиваются в буферном растворе и подвергаются определенному температурному циклу. Этот цикл позволяет скрепочным нитям найти свои комплементарные последовательности на нити каркаса и связать их посредством водородных связей , заставляя каркас складываться в желаемую форму. [9]
Как и в более широкой области ДНК-нанотехнологий, ДНК-оригами может быть сделано динамическим по своей природе с помощью использования различных методов. Три основных метода создания динамической ДНК-оригами-машины — это смещение нитей, опосредованное опорой, ферментативные реакции и укладка оснований. [12] Хотя эти методы используются чаще всего, существуют дополнительные методы создания динамических ДНК-оригами-машин, такие как проектирование направленного компонента и использование броуновского движения для управления вращательным движением структур [13] или использование менее часто используемых явлений самосборки ДНК, таких как G-квадруплексы или i-мотивы, которые могут быть чувствительны к pH. [14]
Модификации могут быть использованы иным образом для воздействия на структурные свойства, для придания уникальной химии наноструктурам или для добавления стимулов-ответов к наноструктурам. Модификации структур могут быть сделаны посредством конъюгации молекул, таких как белки, или посредством химической модификации самих оснований ДНК. Зависимые от pH реакции, зависимые от света реакции и многое другое были показаны посредством модифицированных систем.
Одним из примеров применения создания динамических структур является способность реагировать на стимулы, приводя к высвобождению лекарственных средств, что представлено несколькими группами. [15] [16] Другие, менее распространенные применения заключаются в обнаружении движущихся механизмов in vivo, таких как раскручивание геликазы. [17]
ДНК-оригами, изготовленный из натурального биологического полимера, хорошо подходит для биологической среды, когда позволяет концентрация соли, [1] и обеспечивает точный контроль над расположением молекул и структур в системе. Это позволяет ДНК-оригами быть применимым к ряду сценариев в биомедицинской инженерии. Текущие биомедицинские приложения включают в себя высвобождение лекарств с механизмами 0 порядка, [2] вакцины, [3] клеточную сигнализацию, [4] и сенсорные приложения. [5]
ДНК свернута в октаэдр и покрыта одним бислоем фосфолипида , имитирующим оболочку вирусной частицы. Наночастицы ДНК, каждая размером примерно с вирион, способны оставаться в кровотоке в течение нескольких часов после инъекции мышам. Это также вызывает гораздо более слабый иммунный ответ, чем непокрытые частицы. Это представляет собой потенциальное применение для доставки лекарств, о чем сообщают исследователи из Института Висса при Гарвардском университете. [18] [19]
Исследователи из Института Висса Гарвардского университета сообщили о самоорганизующихся и самоуничтожающихся сосудах для доставки лекарств с использованием ДНК-оригами в лабораторных испытаниях. Созданный ими ДНК-наноробот представляет собой открытую ДНК-трубку с шарниром на одной стороне, который можно застегнуть. Заполненная лекарством ДНК-трубка удерживается закрытой ДНК-аптамером , настроенным на идентификацию и поиск определенного больного белка. Как только оригами-наноботы попадают в инфицированные клетки, аптамеры распадаются и высвобождают лекарство. Первой моделью заболевания, которую использовали исследователи, была лейкемия и лимфома . [20]
Исследователи из Национального центра нанонауки и технологий в Пекине и Университета штата Аризона сообщили о средстве доставки ДНК-оригами для доксорубицина , известного противоракового препарата. Препарат был нековалентно присоединен к наноструктурам ДНК-оригами посредством интеркаляции, и была достигнута высокая лекарственная нагрузка. Комплекс ДНК-доксорубицин был поглощен клетками рака аденокарциномы молочной железы человека ( MCF-7 ) посредством клеточной интернализации с гораздо большей эффективностью, чем доксорубицин в свободной форме. Усиление активности уничтожения клеток наблюдалось не только в обычном MCF-7 , что более важно, также в доксорубицин-резистентных клетках. Ученые предположили, что загруженный доксорубицином ДНК-оригами ингибирует лизосомальное закисление, что приводит к клеточному перераспределению препарата в места действия, тем самым увеличивая цитотоксичность против опухолевых клеток. [21] [22] Дальнейшие испытания in vivo на мышах показывают, что в течение 12-дневного периода доксорубицин был более эффективен в уменьшении размеров опухолей у мышей, когда он содержался в ДНК-оригами наноструктурах или ДОН. [23]
Исследователи из Массачусетского технологического института разрабатывают метод прикрепления различных вирусных антигенов к частицам ДНК в форме вируса, чтобы имитировать вирус, который будет использоваться для разработки новых вакцин. [24] Это было начато в 2016 году, когда лаборатория Бате создала алгоритм, известный как DAEDALUS (алгоритм проектирования последовательности ДНК-оригами для пользовательских структур), для создания точно контролируемых трехмерных форм ДНК. [25] Используя инструмент, они спроектировали каркас в форме вируса, который может модульно прикреплять различные антигены к поверхности каркаса ДНК. В настоящее время Массачусетский технологический институт работает над разработкой оптимальной геометрии для В-клеток для распознавания антигенов ВИЧ. Дальнейшие исследования пытались заменить антигены ВИЧ на SARS-CoV-2 и проверяют, показывают ли вакцины надлежащий иммунный ответ от изолированных В-клеток и у мышей. [26]
Аналогичным образом, исследователи из Мюнхенского технического университета разработали метод, позволяющий Т-клеткам нацеливаться на опухолевые клетки с помощью ДНК-оригами, покрытых антигеном. [27] Исследователи разработали метод создания шасси, известного как программируемые Т-клеточные энгагеры или (PTE), которые представляют собой структуры ДНК-оригами, которые можно настроить для связывания с заданными пользователем целевыми клетками и Т-клетками на основе того, какие антигены нанесены на поверхности наноструктуры. Результаты in vitro показывают, что после 24 часов воздействия 90% опухолевых клеток были уничтожены. Между тем, тестирование in vivo показало, что их PTE были способны связываться с целевыми белками в течение нескольких часов, что подтверждает разработанный ими механизм. [28]
В литературе было предложено множество потенциальных приложений, включая иммобилизацию ферментов, системы доставки лекарств и нанотехнологическую самосборку материалов. Хотя ДНК не является естественным выбором для создания активных структур для наноробототехнических приложений из-за отсутствия структурной и каталитической универсальности, в нескольких работах рассматривалась возможность молекулярных шагающих роботов на оригами и переключателей для алгоритмических вычислений. [8] [29] В следующих параграфах перечислены некоторые из зарегистрированных приложений, проведенных в лабораториях с клиническим потенциалом.
В исследовании, проведенном группой ученых из центра iNANO и центра CDNA в университете Орхуса , исследователи смогли сконструировать небольшую многопереключаемую 3D ДНК-коробку-оригами. Предложенная наночастица была охарактеризована с помощью АСМ , ТЭМ и FRET . Было показано, что сконструированная коробка имеет уникальный механизм повторного закрытия, который позволяет ей многократно открываться и закрываться в ответ на уникальный набор ключей ДНК или РНК. Авторы предположили, что это «устройство ДНК может потенциально использоваться для широкого спектра приложений, таких как управление функцией отдельных молекул, контролируемая доставка лекарств и молекулярные вычисления». [30]
Нанороботы, сделанные из ДНК-оригами, продемонстрировали вычислительные возможности и выполнили заранее запрограммированную задачу внутри живого организма, о чем сообщила группа биоинженеров из Института Висса Гарвардского университета и Института нанотехнологий и передовых материалов Университета Бар-Илан . В качестве доказательства концепции группа ввела различные виды наноботов (молекулы с закрученной ДНК, содержащие флуоресцентные маркеры) живым тараканам. Отслеживая маркеры внутри тараканов, группа обнаружила, что точность доставки молекул (высвобождаемых развернутой ДНК) в целевые клетки, взаимодействия между наноботами и управление эквивалентны компьютерной системе. Сложность логических операций, решений и действий увеличивается с увеличением числа наноботов. Группа подсчитала, что вычислительная мощность таракана может быть увеличена до мощности 8-битного компьютера. [31] [32]
Исследовательская группа в Индийском институте науки использовала наноструктуры для разработки платформы для выяснения коаксиальной укладки между основаниями ДНК. Этот подход использовал микроскопию сверхвысокого разрешения на основе DNA-PAINT для визуализации этих наноструктур ДНК и выполнил анализ кинетики связывания ДНК для выяснения фундаментальной силы укладки оснований, которая помогает стабилизировать двойную спиральную структуру ДНК. Затем они собрали мультимерные наноструктуры ДНК-оригами, называемые «трехконечной звездой», в тетраэдрическую трехмерную структуру оригами. Сборка основывалась главным образом на взаимодействиях укладки оснований между каждой субъединицей. Группа далее показала, что знание таких взаимодействий может быть использовано для прогнозирования и, таким образом, настройки относительной стабильности этих мультимерных наноструктур ДНК. [33]
Идея использования дизайна белка для достижения тех же целей, что и ДНК-оригами, также всплыла. Исследователи из Национального института химии в Словении работают над использованием рационального дизайна сворачивания белка для создания структур, очень похожих на те, что наблюдаются в ДНК-оригами. Основное внимание в текущих исследованиях дизайна сворачивания белка уделяется области доставки лекарств с использованием антител, прикрепленных к белкам, как способ создания целевого транспортного средства. [34] [35]