stringtranslate.com

Taq-полимераза

Taq -полимераза представляет собой термостабильную ДНК-полимеразу I, названную в честь термофильного эубактериального микроорганизма Thermus aquaticus , из которого она была первоначально выделена Chien et al. в 1976 году. [1] Его название часто сокращают до Taq или Taq pol . Его часто используют в полимеразной цепной реакции (ПЦР), методе значительного увеличения количества коротких сегментов ДНК .

T. aquaticus — это бактерия , обитающая в горячих источниках и гидротермальных источниках , а Taq- полимераза была идентифицирована [1] как фермент , способный противостоять условиям денатурации белка (высокая температура), необходимым во время ПЦР. [2] Таким образом, он заменил ДНК-полимеразу E. coli, первоначально использовавшуюся в ПЦР. [3]

Ферментативные свойства

Оптимальная температура активности Taq составляет 75–80 ° C, период полураспада составляет более 2 часов при 92,5 ° C, 40 минут при 95 ° C и 9 минут при 97,5 ° C, и он может воспроизводить пару оснований из 1000. цепь ДНК менее чем за 10 секунд при 72 °C. [4] При 75–80 ° C Taq достигает оптимальной скорости полимеризации , составляющей около 150 нуклеотидов в секунду на молекулу фермента, и любые отклонения от оптимального температурного диапазона подавляют скорость расширения фермента. Один Taq синтезирует около 60 нуклеотидов в секунду при 70 °C, 24 нуклеотида в секунду при 55 °C, 1,5 нуклеотидов в секунду при 37 °C и 0,25 нуклеотидов в секунду при 22 °C. При температуре выше 90 °C Taq проявляет очень небольшую активность или вообще не проявляет ее, но сам фермент не денатурирует и остается неповрежденным. [5] Наличие определенных ионов в реакционном сосуде также влияет на удельную активность фермента. Небольшие количества хлорида калия (KCl) и ионов магния (Mg 2+ ) способствуют ферментативной активности Taq . Taq- полимераза максимально активируется при 50 мМ KCl, тогда как оптимальная концентрация Mg 2+ определяется концентрацией нуклеозидтрифосфатов (dNTP). Высокие концентрации KCl и Mg 2+ ингибируют активность Taq . [6] Обычный хелатор ионов металлов ЭДТА напрямую связывается с Taq в отсутствие ионов этих металлов. [7]

Одним из недостатков Taq является отсутствие корректирующей активности экзонуклеазы от 3' до 5' [4], что приводит к относительно низкой точности репликации. Первоначально частота ошибок составляла примерно 1 на 9000 нуклеотидов. [8] Некоторые термостабильные ДНК-полимеразы были выделены из других термофильных бактерий и архей, такие как ДНК-полимераза Pfu , обладающая корректурной активностью, и используются вместо Taq (или в сочетании с ним) для высокоточной амплификации. [9] Точность может сильно различаться в зависимости от Taq, что имеет серьезные последствия для последующих приложений секвенирования. [10]

Taq производит продукты ДНК, у которых на 3'-концах имеется выступающий А ( аденин ). Это может быть полезно при клонировании ТА , при котором используется клонирующий вектор (такой как плазмида ), имеющий 3'-конец Т ( тимин ), который дополняет выступ А-конца продукта ПЦР, что позволяет лигировать продукт ПЦР в плазмидный вектор.

В ПЦР

В начале 1980-х Кэри Маллис работал в Cetus Corporation над применением синтетических ДНК в биотехнологии . Он был знаком с использованием ДНК- олигонуклеотидов в качестве зондов для связывания с целевыми цепями ДНК, а также с их использованием в качестве праймеров для секвенирования ДНК и синтеза кДНК . В 1983 году он начал использовать два праймера, один для гибридизации с каждой цепью целевой ДНК, и добавлять в реакцию ДНК-полимеразу . Это привело к экспоненциальной репликации ДНК , [11] значительно усиливающей дискретные сегменты ДНК между праймерами. [3]

Однако после каждого раунда репликации смесь необходимо нагреть выше 90 ° C, чтобы денатурировать вновь образованную ДНК, позволяя нитям разделиться и действовать как матрицы в следующем раунде амплификации. Этот этап нагревания также инактивирует ДНК-полимеразу, которая использовалась до открытия Taq -полимеразы, фрагмента Кленова (полученного из E. coli ). Taq- полимераза хорошо подходит для этого применения, поскольку она способна выдерживать температуру 95 ° C, необходимую для разделения цепей ДНК без денатурации.

Использование термостабильного Taq позволяет проводить ПЦР при высокой температуре (~60 °C и выше), что способствует высокой специфичности праймеров и снижает образование неспецифических продуктов, таких как димер праймера . Кроме того, использование термостабильной полимеразы устраняет необходимость добавления нового фермента в каждый цикл термоциклирования. Для выполнения всего процесса можно использовать одну закрытую трубку в относительно простой машине . Таким образом, использование Taq -полимеразы стало ключевой идеей, которая сделала ПЦР применимой для решения широкого спектра задач молекулярной биологии, связанных с анализом ДНК. [2]

Патентные вопросы

В конечном итоге Hoffmann-La Roche купила у Cetus патенты на PCR и Taq за 330 миллионов долларов, из которых могла получить до 2 миллиардов долларов гонораров. [12] В 1989 году журнал Science Magazine назвал Taq -полимеразу своей первой « Молекулой года ». Кэри Маллис получил Нобелевскую премию по химии в 1993 году — единственную премию, присуждаемую за исследования, проведенные в биотехнологической компании. К началу 1990-х годов метод ПЦР с Taq -полимеразой использовался во многих областях, включая фундаментальные исследования в области молекулярной биологии, клинические испытания и судебную экспертизу . Он также начал находить актуальное применение для прямого выявления ВИЧ при СПИДе . [13]

В декабре 1999 года окружной судья США Вон Уокер постановил, что патент 1990 года на полимеразу Taq был выдан частично на основании вводящей в заблуждение информации и ложных заявлений ученых из Cetus Corporation . Постановление поддержало иск корпорации Promega против компании Hoffman-La Roche , которая приобрела патенты Taq в 1991 году. Судья Уокер сослался на предыдущие открытия, сделанные другими лабораториями, включая лабораторию профессора Джона Трелы на факультете биологических наук Университета Цинциннати , как основание для постановления. [14]

Доменная структура

Taq Pol A имеет общую структуру, аналогичную структуре PolA E. coli . Средний 3'-5'-домен экзонуклеазы, ответственный за корректуру, резко изменился и не функционирует. [15] Он имеет функциональный 5'-3' экзонуклеазный домен на аминоконце, описанный ниже. Остальные два домена действуют согласованно посредством связанного движения доменов. [16]

Экзонуклеазный домен

Экзонуклеаза Taq- полимеразы представляет собой домен, обнаруженный на аминоконце Taq ДНК- полимеразы I (термостабильной). Он предполагает рибонуклеазный H-подобный мотив . Домен придаетполимеразе 5' -3' экзонуклеазную активность. [17]

В отличие от того же домена в E. coli , который разрушает праймеры и должен быть удален путем расщепления для использования в ПЦР, [9] не считается, что этот домен разрушает праймер. [18] Эта активность используется в зонде TaqMan : по мере формирования дочерних цепей зонды, комплементарные матрице, вступают в контакт с полимеразой и расщепляются на флуоресцентные фрагменты. [19]

Связывание с ДНК

Taq- полимераза связывается в щели своего активного сайта полимеразы с тупым концом дуплексной ДНК. Когда Taq- полимераза контактирует со связанной ДНК, ее боковые цепи образуют водородные связи с пуринами и пиримидинами ДНК. Тот же участок Taq -полимеразы, который связан с ДНК, также связывается с экзонуклеазой. Эти структуры, связанные с Taq -полимеразой, имеют разные взаимодействия.

Мутанты

Сообщалось об эксперименте по сайт-направленному мутагенезу, который улучшает активность рудиментарной 3'-5'-экзонуклеазы в 2 раза, но никогда не сообщалось, снижает ли это частоту ошибок . [20] Следуя аналогичному подходу, белки-химеры были созданы с помощью доменов, собирающих вишню, из E. coli , Taq и полимеразы I T. neapolitana . Замена рудиментарного домена на функциональный из E. coli создала белок с корректурной способностью, но с более низкой оптимальной температурой и низкой термостабильностью. [21]

Были созданы версии полимеразы без 5'-3' экзонуклеазного домена, среди которых наиболее известны Klentaq или фрагмент Стоффеля . Полное отсутствие экзонуклеазной активности делает эти варианты пригодными для праймеров, обладающих вторичной структурой, а также для копирования кольцевых молекул. [9] Другие варианты включают использование Klentaq с высокоточной полимеразой, термосеквеназы , которая распознает субстраты, такие как ДНК-полимераза T7 , мутантов с более высокой толерантностью к ингибиторам или версий с «доменной меткой», которые имеют дополнительный мотив спираль-шпилька-спираль. вокруг каталитического сайта, чтобы более прочно удерживать ДНК, несмотря на неблагоприятные условия. [22]

Так -полимераза

Значение в выявлении заболеваний

Благодаря усовершенствованиям Taq -полимеразы, обеспечиваемым репликацией ДНК ПЦР: более высокой специфичностью, меньшим количеством неспецифических продуктов, а также более простыми процессами и оборудованием, она сыграла важную роль в усилиях по обнаружению заболеваний. «Использование полимеразной цепной реакции (ПЦР) в диагностике инфекционных заболеваний привело к возможности ранней диагностики и надлежащего лечения заболеваний, вызванных прихотливыми патогенами, определения чувствительности к противомикробным препаратам медленно растущих организмов и определения масштаба инфекции». [23] Внедрение Taq -полимеразы спасло бесчисленное количество жизней. Он сыграл важную роль в выявлении многих худших заболеваний в мире, в том числе: туберкулеза, стрептококкового фарингита, атипичной пневмонии, СПИДа, кори, гепатита и язвенных урогенитальных инфекций. ПЦР, метод, используемый для воссоздания копий определенных образцов ДНК, делает возможным обнаружение заболеваний путем нацеливания на определенную последовательность ДНК целевого патогена из образца пациента и амплификации следовых количеств индикаторных последовательностей путем их копирования до миллиардов раз. Хотя это наиболее точный метод выявления заболеваний, особенно ВИЧ, он применяется не так часто, как альтернативные, худшие тесты, из-за относительно высокой стоимости, трудозатрат и времени. [24]

Использование Taq- полимеразы в качестве катализатора процесса репликации ПЦР было подчеркнуто во время пандемии COVID-19 в 2020 году. Нехватка необходимого фермента ослабила способность стран мира производить наборы для тестирования на вирус. Без Taq -полимеразы процесс выявления заболеваний становится намного медленнее и утомительнее. [25]

Несмотря на преимущества использования Taq -полимеразы при выявлении заболеваний с помощью ПЦР, этот фермент не лишен недостатков. Ретровирусные заболевания (ВИЧ, HTLV-1 и HTLV-II) часто включают в своем геноме мутации от гуанина к аденину. Подобные мутации позволяют ПЦР-тестам выявлять заболевания, но относительно низкая точность Taq- полимеразы приводит к возникновению той же мутации G-to-A и, возможно, к ложноположительному результату теста. [26]

Смотрите также

На Wikimedia Commons есть СМИ, связанные с Taq-полимеразой .

Рекомендации

  1. ^ Аб Чиен А, Эдгар Д.Б., Трела Дж.М. (сентябрь 1976 г.). «Полимераза дезоксирибонуклеиновой кислоты крайнего термофила Thermus aquaticus». Журнал бактериологии . 127 (3): 1550–7. дои : 10.1128/jb.127.3.1550-1557.1976. ПМК  232952 . ПМИД  8432.
  2. ^ аб Сайки Р.К., Гельфанд Д.Х., Стоффель С., Шарф С.Дж., Хигучи Р., Хорн Г.Т. и др. (январь 1988 г.). «Праймер-направленная ферментативная амплификация ДНК с помощью термостабильной ДНК-полимеразы». Наука . 239 (4839): 487–91. Бибкод : 1988Sci...239..487S. дои : 10.1126/science.2448875. ПМИД  2448875.
  3. ^ ab Сайки РК, Шарф С., Фалуна Ф, Муллис КБ, Хорн Г.Т., Эрлих Х.А., Арнгейм Н. (декабрь 1985 г.). «Ферментативная амплификация геномных последовательностей бета-глобина и анализ сайтов рестрикции для диагностики серповидноклеточной анемии». Наука . 230 (4732): 1350–4. Бибкод : 1985Sci...230.1350S. дои : 10.1126/science.2999980. PMID  2999980. Архивировано из оригинала 19 декабря 2008 г.
  4. ^ ab Lawyer FC, Стоффель С., Сайки РК, Чанг С.Ю., Ландре П.А., Абрамсон Р.Д., Гельфанд Д.Х. (май 1993 г.). «Высокоуровневая экспрессия, очистка и ферментативная характеристика полноразмерной ДНК-полимеразы Thermus aquaticus и усеченной формы с дефицитом экзонуклеазной активности от 5' до 3'». Методы и приложения ПЦР . 2 (4): 275–87. дои : 10.1101/гр.2.4.275 . ПМИД  8324500.
  5. ^ Протоколы ПЦР: руководство по методам и приложениям . Иннис, Майкл А. Сан-Диего: Academic Press. 1990. ISBN 978-0123721808. ОСЛК  19723112.{{cite book}}: CS1 maint: другие ( ссылка )
  6. ^ Технология ПЦР: принципы и применение амплификации ДНК . Эрлих, Генри А., 1943-. Нью-Йорк: Стоктон Пресс. 1989. ISBN 978-0333489482. ОКЛК  19323242.{{cite book}}: CS1 maint: другие ( ссылка )
  7. ^ Лопата А, Жойарт Б, Сураньи ЭВ, Такач Э, Безур Л, Левелес I и др. (октябрь 2019 г.). «Помимо хелатирования: ЭДТА прочно связывает ДНК-полимеразу Taq, MutT и dUTPase и напрямую ингибирует активность dNTPase». Биомолекулы . 9 (10): 621. дои : 10.3390/biom9100621 . ПМЦ 6843921 . ПМИД  31627475. 
  8. ^ Тиндалл К.Р., Кункель Т.А. (август 1988 г.). «Правильность синтеза ДНК ДНК-полимеразой Thermus aquaticus». Биохимия . 27 (16): 6008–13. дои : 10.1021/bi00416a027. ПМИД  2847780.
  9. ^ abc ван Пелт-Веркуил Э, ван Белкум А, Хейс Дж. П. (2008). «Taq и другие термостабильные ДНК-полимеразы». Принципы и технические аспекты ПЦР-амплификации . стр. 103–18. дои : 10.1007/978-1-4020-6241-4_7. ISBN 978-1-4020-6240-7.
  10. ^ Брандарис-Фонтес С., Камачо-Санчес М., Вила С., Вега-Пла Дж.Л., Рико С., Леонард Дж.А. (январь 2015 г.). «Влияние фермента и условий ПЦР на качество результатов высокопроизводительного секвенирования ДНК». Научные отчеты . 5 : 8056. Бибкод : 2015NatSR...5E8056B. дои : 10.1038/srep08056. ПМК 4306961 . ПМИД  25623996. 
  11. ^ Муллис КБ (апрель 1990 г.). «Необычное происхождение полимеразной цепной реакции». Научный американец . 262 (4): 56–61, 64–5. Бибкод : 1990SciAm.262d..56M. doi : 10.1038/scientificamerican0490-56. ПМИД  2315679.
  12. ^ Фор Дж., Вичерс И.Р., Кук-Диган Р. (июль 2006 г.). «Влияние деловой практики, лицензирования и интеллектуальной собственности на разработку и распространение полимеразной цепной реакции: практический пример». Журнал биомедицинских открытий и сотрудничества . 1 :7. дои : 10.1186/1747-5333-1-7 . ПМЦ 1523369 . ПМИД  16817955. 
    Подробная история корпорации Cetus и коммерческие аспекты ПЦР.
  13. ^ Гуателли Дж.К., Гингерас Т.Р., Ричман Д.Д. (апрель 1989 г.). «Амплификация нуклеиновых кислот in vitro: обнаружение последовательностей с низким числом копий и применение для диагностики инфекции вируса иммунодефицита человека типа 1». Обзоры клинической микробиологии . 2 (2): 217–26. дои : 10.1128/CMR.2.2.217. ПМК 358112 . ПМИД  2650862. 
  14. ↑ Карран, Крис, Биомедицина, 7 декабря 1999 г.
  15. ^ Эом Ш., Ван Дж., Стейц Т.А. (июль 1996 г.). «Структура Taq-полимеразы с ДНК в активном центре полимеразы». Природа . 382 (6588): 278–81. Бибкод : 1996Natur.382..278E. дои : 10.1038/382278a0. PMID  8717047. S2CID  4372845.
  16. ^ Бу З, Биль Р., Монкенбуш М., Рихтер Д., Callaway DJ (декабрь 2005 г.). «Связанное движение белковых доменов в Taq-полимеразе, выявленное с помощью спектроскопии нейтронного спинового эха». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 102 (49): 17646–51. Бибкод : 2005PNAS..10217646B. дои : 10.1073/pnas.0503388102 . ПМЦ 1345721 . ПМИД  16306270. 
  17. ^ Ли Ю, Митаксов В, Ваксман Г (август 1999 г.). «Структурный дизайн ДНК-полимераз Taq с улучшенными свойствами включения дидезоксинуклеотидов». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 96 (17): 9491–6. Бибкод : 1999PNAS...96.9491L. дои : 10.1073/pnas.96.17.9491 . ПМК 22236 . ПМИД  10449720. 
  18. ^ «Будет ли эндонуклеазная активность 5'→3' лоскута ДНК-полимеразы Taq разрушать праймеры?». НЭБ . Проверено 28 марта 2019 г.
  19. ^ Экспрессия гена TaqMan - Проекты NCBI
  20. ^ Пак Ю, Чой Х, Ли Д.С., Ким Ю (июнь 1997 г.). «Улучшение 3'-5' экзонуклеазной активности ДНК-полимеразы Taq путем белковой инженерии в активном центре». Молекулы и клетки . 7 (3): 419–24. ПМИД  9264032.
  21. ^ Виллбрандт Б., Собек Х., Фрей Б., Шомбург Д. (сентябрь 2000 г.). «Обмен доменами: химеры ДНК-полимеразы Thermus aquaticus, ДНК-полимеразы I Escherichia coli и ДНК-полимеразы Thermotoga neapolitana». Белковая инженерия . 13 (9): 645–54. дои : 10.1093/протеин/13.9.645 . ПМИД  11054459.
  22. ^ Исино С, Исино Ю (2014). «ДНК-полимеразы как полезные реагенты для биотехнологии - история исследований в этой области». Границы микробиологии . 5 : 465. дои : 10.3389/fmicb.2014.00465 . ПМК 4148896 . ПМИД  25221550. 
  23. ^ Менон П.К., Капила К., Охри В.К. (июль 1999 г.). «Полимеразная цепная реакция и достижения в диагностике инфекционных заболеваний». Медицинский журнал Вооруженных сил Индии . 55 (3): 229–231. дои : 10.1016/S0377-1237(17)30450-1. ПМЦ 5531883 . ПМИД  28775636. 
  24. ^ «Полимеразная цепная реакция (ПЦР)» . stanfordhealthcare.org . Проверено 23 апреля 2020 г.
  25. ^ «Глава FDA предупреждает о «давлении» на поставку реагентов для тестов на коронавирус» . Медтех-дайв . Проверено 23 апреля 2020 г.
  26. ^ Овербо Дж., Джексон С.М., Папенхаузен М.Д., Руденси Л.М. (ноябрь 1996 г.). «Лентивирусные геномы с гипермутацией G-на-A могут быть результатом ошибок Taq-полимеразы во время полимеразной цепной реакции». Исследования СПИДа и ретровирусы человека . 12 (17): 1605–13. дои : 10.1089/aid.1996.12.1605. ПМИД  8947295.