Джей Д. Кислинг — профессор [ неоднозначно ] химической инженерии и биоинженерии в Калифорнийском университете в Беркли . [2] Он также является заместителем директора лаборатории биологических наук в Национальной лаборатории Лоуренса в Беркли и главным исполнительным директором Объединенного института биоэнергетики . [3] Он считается одним из ведущих авторитетов в области синтетической биологии , особенно в области метаболической инженерии .
В 2010 году Кислинг был избран членом Национальной инженерной академии за разработку инструментов синтетической биологии для создания противомалярийного препарата артемизинина.
Кислинг получил степень бакалавра в Университете Небраски-Линкольна , где он был членом Международного братства Дельта Тау Дельта . Затем он получил степень доктора философии в Мичиганском университете в 1991 году под руководством Бернхарда Палссона . [4] Кислинг проводил постдокторские исследования с Артуром Корнбергом в Стэнфордском университете в 1991–1992 годах.
Текущие [ когда? ] исследования Кислинга [5] сосредоточены на инженерной химии внутри микроорганизмов, области, известной как метаболическая инженерия, для производства полезных химикатов или для очистки окружающей среды. Во многом так же, как синтетическая органическая и промышленная химия позволила химикам и химическим инженерам производить из ископаемых топливных ресурсов химикаты, которые мы используем каждый день, метаболическая инженерия может произвести революцию в производстве некоторых из тех же самых полезных химикатов и больше из возобновляемых ресурсов, таких как сахар и целлюлозная биомасса. В течение многих лет работа в области метаболической инженерии была ограничена отсутствием ферментов для выполнения необходимой химии и инструментов для манипулирования и мониторинга химии внутри клеток. Видя потребность в более совершенных генетических инструментах, Кислинг начал работать над разработкой генетических инструментов, областью, теперь известной как синтетическая биология. Лаборатория Кислинга разработала или внедрила многие из новейших аналитических инструментов для устранения неполадок наших генетических манипуляций. Лаборатория Кислинга применила метаболическую химию к ряду реальных проблем, включая производство противомалярийного препарата артемизинина и биотоплива. Кислинг опубликовал более 300 статей в рецензируемых журналах и имеет более 30 выданных патентов.
Малярия является глобальной проблемой здравоохранения, которая угрожает 300–500 миллионам человек и ежегодно убивает более миллиона человек. Препараты на основе хлорохина, которые широко использовались в прошлом, утратили эффективность, поскольку паразит Plasmodium, вызывающий малярию, стал устойчивым к ним. Артемизинин, сесквитерпеновый лактон эндопероксид, извлеченный из Artemisia annua L, очень эффективен против Plasmodium spp., устойчивых к другим противомалярийным препаратам. Однако существует несколько проблем с текущими методами производства артемизинина. Во-первых, комбинированная терапия артемизинином (АКТ) слишком дорога для людей в развивающихся странах. [6] Во-вторых, артемизинин извлекается из A. annua , и его выход и консистенция зависят от климата и процесса экстракции. Хотя существует метод химического синтеза артемизинина, он слишком малопроизводителен и, следовательно, слишком дорог для использования в производстве недорогих лекарств. В-третьих, хотя Всемирная организация здравоохранения рекомендовала включать артемизинин в состав АКТ вместе с другими активными фармацевтическими ингредиентами, многие производители по-прежнему выпускают монопрепараты артемизинина, что увеличивает вероятность того, что у Plasmodium spp. разовьется резистентность к артемизинину.
Лаборатория Кислинга в Калифорнийском университете в Беркли сконструировала Escherichia coli и Saccharomyces cerevisiae для производства артемизиновой кислоты, предшественника артемизинина, который может быть дериватизирован с использованием устоявшейся, простой и недорогой химии для образования артемизинина или любого производного артемизинина, в настоящее время используемого для лечения малярии. [7] Микроорганизмы были сконструированы с помощью десятиферментного биосинтетического пути с использованием генов Artemisia annua , Saccharomyces cerevisiae и Escherichia coli (всего двенадцать генов) для преобразования простого и возобновляемого сахара, такого как глюкоза, в сложную химическую структуру противомалярийного препарата артемизинина. Сконструированный микроорганизм способен секретировать конечный продукт из клетки, тем самым очищая его от всех других внутриклеточных химикатов и снижая затраты на очистку и, следовательно, стоимость конечного препарата. Учитывая существование известных, относительно высокопродуктивных химических процессов для превращения артемизиновой кислоты в артемизинин или любое другое производное артемизинина, произведенная микробами артемизиновая кислота является жизнеспособным, возобновляемым и масштабируемым источником этого мощного семейства противомалярийных препаратов. [8]
Важнейшим элементом работы Кислинга была разработка генетических инструментов для помощи в манипулировании микробным метаболизмом, особенно для малоценных продуктов, требующих высоких выходов сахара. Его лаборатория разработала однокопийные плазмиды для экспрессии сложных метаболических путей, промоторные системы, которые позволяют регулировать контроль транскрипции последовательно во всех клетках культуры, технологии стабилизации мРНК для регулирования стабильности сегментов мРНК [9] и подход белковой инженерии для присоединения нескольких ферментов метаболического пути к синтетическому белковому каркасу для увеличения потока пути. [10] Эти и другие инструменты экспрессии генов теперь позволяют точно контролировать экспрессию генов, которые кодируют новые метаболические пути, чтобы максимизировать химическое производство, минимизировать потери побочных продуктов и минимизировать накопление токсичных промежуточных продуктов, которые могут отравить микробного хозяина, все из которых важны для экономичного производства этого важного препарата.
Другим важным аспектом работы Кислинга было открытие химии и ферментов в Artemisia annua , ответственных за синтез артемизинина. [11] [12] Эти ферменты включали цитохром P450, который окисляет аморфадиен до артемизиновой кислоты, и окислительно-восстановительные партнеры, которые переносят восстановительные эквиваленты от фермента к кофакторам. Открытие этих ферментов и их функциональное выражение как в дрожжах, так и в E. coli , наряду с другими девятью ферментами в метаболическом пути, позволило производить артемизиновую кислоту этими двумя микроорганизмами. [12] [13] S. cerevisiae был выбран для крупномасштабного процесса производства и был дополнительно модифицирован для улучшения производства артемизиновой кислоты. [14]
Процесс микробного производства Кислинга имеет ряд преимуществ по сравнению с экстракцией из растений. Во-первых, микробный синтез снизит стоимость артемизинина, самого дорогого компонента комбинированной терапии на основе артемизинина, — в десять раз — и, следовательно, сделает противомалярийные препараты на основе артемизинина более доступными для людей в развивающихся странах. Во-вторых, погодные условия или политический климат, которые в противном случае могли бы повлиять на урожайность или стоимость растительного варианта препарата, не повлияют на микробный источник препарата. В-третьих, микробное производство артемизинина в больших резервуарах позволит более тщательно распределять артемизинин среди законных производителей лекарств, которые разрабатывают комбинированную терапию на основе артемизинина, а не монотерапию. Это, в свою очередь, замедлит развитие резистентности к этому препарату. В-четвертых, на 2011 год и далее прогнозируется острая нехватка артемизинина растительного происхождения, что увеличит стоимость комбинированной терапии на основе артемизинина. Наконец, артемизиновая кислота микробного происхождения позволит производить новые производные артемизинина, к которым плазмодий может быть неустойчив, тем самым продлевая время, в течение которого артемизинин может быть использован.
Чтобы гарантировать, что разработанный им процесс принесет пользу людям в развивающихся странах, Кислинг собрал уникальную команду, состоящую из его лаборатории в Калифорнийском университете в Беркли, Amyris Biotechnologies (компании, основанной на этой технологии) и Institute for OneWorld Health (некоммерческой фармацевтической компании, расположенной в Сан-Франциско). В дополнение к сбору команды Кислинг разработал модель интеллектуальной собственности, чтобы гарантировать, что полученный микробным путем артемизинин может быть предложен людям в развивающихся странах по максимально низкой цене: патенты, выданные на его работу в UCB, лицензируются без уплаты роялти Amyris Biotechnologies и Institute for OneWorld Health для использования в производстве артемизинина, пока они не приносят прибыли от продажи артемизинина в развивающихся странах. Команда была профинансирована в декабре 2004 года Фондом Билла и Мелинды Гейтс для разработки процесса микробного производства. Наука была завершена в декабре 2007 года. В 2008 году Sanofi-Aventis лицензировала технологию и работала с Amyris над разработкой производственного процесса. Sanofi-Aventis произвела 35 тонн [ когда? ] артемизинина с использованием микробного процесса производства Кислинга, что достаточно для 70 миллионов курсов лечения. Распространение комбинированных терапий на основе артемизинина, содержащих артемизинин микробного происхождения, началось в августе 2014 года с 1,7 миллиона курсов лечения, отправленных в Африку. Ожидается, что 100-150 миллионов курсов лечения будут производиться с использованием этой технологии и ежегодно отправляться в Африку, Азию и Южную Америку.
Возобновляемое топливо необходимо для всех видов транспорта, но большинство видов топлива микробного происхождения можно использовать только в качестве небольшой доли бензина в обычных двигателях с искровым зажиганием. Лаборатория Кислинга сконструировала микроорганизмы для производства углеводородов со свойствами, аналогичными свойствам топлива, которое сейчас получают из нефти. Это топливо синтезируется из сахаров растительного происхождения, таких как целлюлозное сырье, которое имеет небольшую экономическую ценность. Следовательно, микробы могут минимизировать углеродный след, минимизируя затраты энергии на получение топлива, например, бурение на шельфе и гидроразрыв пласта.
Кислинг и его коллеги продемонстрировали, что Escherichia coli и Saccharomyces cerevisiae могут быть сконструированы для производства биотоплива на основе жирных кислот, этиловых эфиров жирных кислот, [15] алкенов, [16] и метилкетонов. [17] Поскольку линейные углеводороды являются ключевыми компонентами дизельного топлива, эти биологически полученные виды топлива являются отличной заменой дизельному топливу. Однако топливо, содержащее только длинные линейные углеводородные цепи, замерзает при низких температурах. Чтобы разработать топливо, подходящее для холодного применения, лаборатория Кислинга сконструировала E. coli и S. cerevisiae для производства разветвленных и циклических углеводородов с использованием изопреноидного биосинтетического пути: изопентанол, замена бензина; [18] пинен, замена реактивного топлива; [19] и бисаболен, замена дизельного топлива. [20] Поскольку изопреноиды добавляют метильную боковую цепь к каждых четырем атомам углерода в основной цепи, топливо, изготовленное из изопреноидов, имеет очень низкие температуры замерзания и помутнения, что делает его пригодным для использования в качестве дизельного топлива для холодной погоды и реактивного топлива.
Одной из самых больших проблем в масштабировании микробной ферментации является стабильность микробного штамма: сконструированный микроорганизм будет пытаться мутировать или сбросить метаболический путь, отчасти потому, что промежуточные продукты в метаболическом пути накапливаются и токсичны для клеток. Чтобы сбалансировать поток путей и снизить стоимость производства желаемого биотоплива, лаборатория Кислинга разработала динамические регуляторы для определения уровней промежуточных продуктов в пути и регулирования активности пути. [21] Эти регуляторы стабилизировали путь и клетку и улучшили выход биотоплива, что позволило выращивать сконструированные клетки в крупномасштабных ферментационных емкостях для производства топлива.
Многие из лучших видов топлива и химикатов токсичны для организма-производителя. Один из способов ограничить токсичность топлива — активно выкачивать топливо из клетки. Чтобы определить насосы, идеально подходящие для определенного топлива, Кислинг и его коллеги провели биоразведку микроорганизмов окружающей среды для многих различных трехкомпонентных транспортеров и выбрали насосы, наиболее эффективные для определенного топлива. [22] Эти транспортеры позволили E. coli расти в присутствии топлива и, как следствие, производить больше целевого топлива, чем она могла бы сделать в отсутствие транспортера.
Исходные материалы (обычно сахара) являются наиболее значимым фактором в стоимости производства биотоплива. Целлюлоза, потенциально недорогой исходный материал, должна быть деполимеризована в сахара путем добавления дорогостоящего коктейля ферментов. Один из способов снизить эту стоимость — спроектировать микроб, производящий топливо, чтобы он также производил ферменты для деполимеризации целлюлозы и гемицеллюлозы. Недавно лаборатория Кислинга продемонстрировала, что микроорганизм может быть сконструирован для синтеза и секреции ферментов для деполимеризации целлюлозы и гемицеллюлозы в сахара и для производства замены бензина (бутанол), замены дизельного топлива (этиловый эфир жирной кислоты) или замены реактивного топлива (пинен). [23]
Как технологическая платформа, производство биотоплива сталкивается с огромными экономическими препятствиями, многие из которых зависят от рыночных цен на сырую нефть и другие виды топлива, получаемые традиционным способом. Тем не менее, метаболическая инженерия — это технология, которая становится все более конкурентоспособной и, как ожидается, будет иметь широкомасштабные эффекты к 2020 году.
Кислинг является основателем Amyris (совместно с Винсентом Мартином, Джеком Ньюманом, Нилом Реннингером и Кинкэдом Рейлингом), LS9 (теперь часть REG вместе с Джорджем Чёрчем и Крисом Соммервиллем) и Lygos (совместно с Леонардом Кацем, Клемом Фортманом, Джеффри Дитрихом и Эриком Стином).
Кислинг родом из Гарварда, штат Небраска , и является открытым геем. [28]