В биохимии иммуноокрашивание — это любое использование метода на основе антител для обнаружения определенного белка в образце. Термин «иммуноокрашивание» первоначально использовался для обозначения иммуногистохимического окрашивания срезов тканей, впервые описанного Альбертом Кунсом в 1941 году. [1] Однако сейчас иммуноокрашивание охватывает широкий спектр методов, используемых в гистологии , клеточной биологии и молекулярной биологии. которые используют методы окрашивания на основе антител.
Иммуногистохимия или ИГХ-окрашивание срезов тканей (или иммуноцитохимия , то есть окрашивание клеток ), возможно, является наиболее часто применяемым методом иммуноокрашивания. [2] Хотя в первых случаях ИГХ-окрашивания использовались флуоресцентные красители (см. Иммунофлуоресценция ), сейчас используются другие нефлуоресцентные методы с использованием ферментов, таких как пероксидаза (см. Окрашивание иммунопероксидазой ) и щелочная фосфатаза . Эти ферменты способны катализировать реакции, дающие окрашенный продукт, который легко обнаружить с помощью световой микроскопии . Альтернативно, радиоактивные элементы можно использовать в качестве меток, а иммунореакцию можно визуализировать с помощью авторадиографии . [3]
Подготовка или фиксация тканей имеет важное значение для сохранения морфологии клеток и архитектуры тканей. Неправильная или длительная фиксация может значительно снизить способность связывания антител. Многие антигены могут быть успешно продемонстрированы на срезах тканей, фиксированных формалином и залитых в парафин . Однако некоторые антигены не выдерживают даже умеренной фиксации альдегидов. В этих условиях ткани следует быстро заморозить в жидком азоте и разрезать криостатом. К недостаткам замороженных срезов относятся плохая морфология, плохое разрешение при больших увеличениях, сложность разрезания парафиновых срезов и необходимость хранения в замороженном виде. Альтернативно, срезы вибратома не требуют обработки ткани органическими растворителями или высокой температурой, которая может разрушить антигенность или разрушить ее при замораживании-оттаивании. Недостаток вибратомных срезов заключается в том, что процесс получения срезов медленный и трудный при использовании мягких и плохо фиксированных тканей, а также то, что на срезах часто видны следы вибрации или линии вибратома. [ нужна цитата ]
Обнаружение многих антигенов может быть значительно улучшено с помощью методов извлечения антигенов , которые действуют путем разрыва некоторых поперечных связей белков, образующихся в результате фиксации, для обнаружения скрытых антигенных сайтов. Этого можно добиться путем нагревания в течение разной продолжительности (тепловое извлечение эпитопа или HIER) или использования ферментативного расщепления (протеолитическое индуцированное извлечение эпитопа или PIER). [4]
Одной из основных трудностей при ИГХ-окраске является преодоление специфического или неспецифического фона. Оптимизация методов и времени фиксации, предварительная обработка блокирующими агентами, инкубация антител с высоким содержанием соли, а также оптимизация буферов для промывки после антител и времени промывки — все это важно для получения высококачественного иммуноокрашивания. Кроме того, для определения специфичности важно наличие как положительного, так и отрицательного контроля окрашивания. [ нужна цитата ]
Проточный цитометр можно использовать для прямого анализа клеток, экспрессирующих один или несколько специфических белков. Клетки иммуноокрашивают в растворе с использованием методов, аналогичных тем, которые используются для иммунофлуоресценции, а затем анализируют с помощью проточной цитометрии. [ нужна цитата ]
Проточная цитометрия имеет несколько преимуществ перед ИГХ, включая: возможность определять отдельные популяции клеток по их размеру и степени детализации; способность выводить мертвые клетки; улучшенная чувствительность; и многоцветный анализ для одновременного измерения нескольких антигенов. Однако проточная цитометрия может быть менее эффективной при обнаружении чрезвычайно редких популяций клеток, и при отсутствии среза ткани происходит потеря архитектурных взаимоотношений. [5] Проточная цитометрия также требует высоких капитальных затрат, связанных с покупкой проточного цитометра. [ нужна цитата ]
Вестерн-блоттинг позволяет обнаруживать специфические белки в экстрактах, полученных из клеток или тканей, до или после любых стадий очистки . Белки обычно разделяют по размеру с помощью гель-электрофореза перед переносом на синтетическую мембрану с помощью методов сухого, полусухого или влажного блоттинга. Затем мембрану можно исследовать с помощью антител, используя методы, аналогичные иммуногистохимии, но без необходимости фиксации. Обнаружение обычно проводят с использованием антител, связанных с пероксидазой , которые катализируют хемилюминесцентную реакцию. [ нужна цитата ]
Вестерн-блоттинг — это обычный метод молекулярной биологии, который можно использовать для полуколичественного сравнения уровней белка в экстрактах. Разделение по размеру перед блоттингом позволяет измерить молекулярную массу белка по сравнению с известными маркерами молекулярной массы. [ нужна цитата ]
Иммуноферментный анализ или ИФА — это диагностический метод количественного или полуколичественного определения концентрации белка в плазме крови , сыворотке или экстрактах клеток/тканей в формате многолуночного планшета (обычно 96 лунок на планшет). В целом белки в растворе абсорбируются на планшетах для ИФА. Для зондирования планшета используются антитела, специфичные к интересующему белку. Фон сводится к минимуму за счет оптимизации методов блокирования и промывки (как для ИГХ), а специфичность обеспечивается за счет присутствия положительного и отрицательного контроля. Методы обнаружения обычно основаны на колориметрии или хемилюминесценции. [ нужна цитата ]
Электронную микроскопию или ЭМ можно использовать для изучения детальной микроархитектуры тканей или клеток. Иммуно-ЭМ позволяет обнаруживать специфические белки в ультратонких срезах тканей. Антитела, меченные частицами тяжелых металлов (например, золота), можно непосредственно визуализировать с помощью просвечивающей электронной микроскопии . Несмотря на то, что иммуно-ЭМ является мощным средством обнаружения субклеточной локализации белка, он может быть технически сложным, дорогим и требовать строгой оптимизации методов фиксации и обработки тканей. Было предложено биотинилирование белков in vivo для облегчения проблем, вызванных частой несовместимостью окрашивания антителами с протоколами фиксации, которые лучше сохраняют морфологию клеток. [6]
В методах иммуноокрашивания антитела используются для обнаружения конкретного эпитопа белка . Эти антитела могут быть моноклональными или поликлональными . Обнаружение этого первого или первичного антитела можно осуществить несколькими способами.
Как описано ранее, такие ферменты, как пероксидаза хрена или щелочная фосфатаза, обычно используются для катализа реакций, которые дают окрашенный или хемилюминесцентный продукт. Флуоресцентные молекулы можно визуализировать с помощью флуоресцентной или конфокальной микроскопии . [ нужна цитата ]
Применения иммуноокрашивания многочисленны, но чаще всего они используются в клинической диагностике и лабораторных исследованиях . [ нужна цитата ]
Клинически ИГХ используется в гистопатологии для диагностики определенных типов рака на основе молекулярных маркеров. [ нужна цитата ]
В лабораторных исследованиях иммуноокрашивание может использоваться для различных целей, основанных на изучении присутствия или отсутствия белка, его распределения в тканях, его субклеточной локализации, а также изменений в экспрессии или деградации белка.